Cesta p53: smyčky pozitivní a negativní zpětné vazby

Řada studií v literatuře identifikovala 10 smyček pozitivní nebo negativní zpětné vazby v dráze p53 (viz obrázky 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 a 10). Každá z těchto smyček vytváří obvod složený z proteinů, jejichž aktivity nebo rychlosti syntézy jsou ovlivněny aktivací p53, a to zase vede ke změně aktivity p53 v buňce. Z nich je sedm smyček negativní zpětné vazby, které modulují aktivitu p53 (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyklin G, Wip-1 a Siah-1) a tři jsou smyčky pozitivní zpětné vazby (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF a Rb), které modulují aktivitu p53. Všechny tyto sítě nebo obvody jsou autoregulační v tom, že jsou buď indukovány aktivitou p53 na transkripční úrovni, transkripčně potlačovány p53 (p14 / 19 ARF, obrázek 3) nebo jsou regulovány proteiny indukovanými p53. Šest z těchto zpětnovazebních smyček působí prostřednictvím MDM-2 (MDM-2, cyklin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT a Rb) k modulaci aktivity p53.

Vzrušujícím zjištěním je, že dráha p53 je úzce spojena s další transdukcí signálu cesty, které hrají významnou roli při vzniku rakoviny. Jedno z prvních studovaných spojení zahrnuje p14 / p19ARF a MDM-2. Protein AR14 p14 / 19 se váže na protein MDM-2 a moduluje jeho aktivitu ubikvitin ligázy, čímž zvyšuje hladiny proteinu p53 (Honda a Yasuda, 1999) (obrázek 3). Transkripce genu AR14 p14 / 19 je pozitivně regulována E2F-1 (Zhu et al., 1999) a beta-kateninem (Damalas et al., 2001) a negativně regulována samotným p53. Kromě toho jsou hladiny proteinu p14 / 19 ARF zvýšeny aktivitami Ras a Myc v buňce (obrázek 3). Složitost regulace p53 AR14 p14 / p19 byla nedávno přezkoumána (Lowe a Sherr, 2003). Komplexy p14 / 19 ARF-MDM-2 jsou často lokalizovány v nukleolu buňky kvůli signálům nukleolární lokalizace přítomným v p14 / p19 ARF. Nukleol je místem ribozomální biogeneze a samotná aktivita AR14 p14 / 19 může změnit rychlost zpracování RNA prekurzoru ribozomální RNA na zralé ribozomální podjednotky (Sugimoto et al., 2003). Proto hraje důležitou roli v regulaci buněčného cyklu AR14 p14 / 19 řízením hladin MDM-2 a p53 a jeho koordinací s ribozomální biogenezí. To bylo nedávno posíleno demonstrací, že protein ARF p14 / 19 může také regulovat aktivitu Myc (a tedy velikost buněk) (Datta et al., 2004). MDM-2 v jádře však není pasivní entitou. Ukázalo se, že protein MDM-2 se specificky váže na tři velké ribozomální podjednotkové proteiny L5, L11 a L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004. ) a vazba L5 (Dai a Lu, 2004) nebo L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) na MDM-2 snižuje jeho aktivitu ubikvitin ligázy. Kromě toho se prstencová doména MDM-2 váže specificky na sekvenci RNA nalezenou ve velké ribozomální RNA podjednotce (Elenbaas et al., 1996). Zatímco všechna tato pozorování poukazují na ústřední roli MDM-2 a p14 / 19 ARF v regulaci biogeneze ribozomu a buněčného cyklu, nerozumíme tomu, jak se tato pozorování spojují a tvoří tuto regulační smyčku.

Protein Rb lze nalézt v buňkách v komplexu s MDM-2 a p53, což má za následek vysokou aktivitu p53 a zvýšenou apoptotickou aktivitu (Xiao et al., 1995). Vysoká hladina aktivního E2F-1, který není vázán na Rb, přepíná reakci p53 ze zástavy G-1 na apoptózu. Jak Rb, tak MDM-2 jsou fosforylovány a inhibovány cyklinem E-cdk2 (obrázek 4). Když je p53 aktivován, stimuluje syntézu proteinu p21, který inhibuje aktivitu cyklinu E-cdk2, a to zase působí na komplex Rb-MDM-2, který podporuje aktivitu p53 a apoptózu. Po poškození DNA je protein MDM-2 i protein p53 modifikován proteinovou kinázou ATM (obrázek 4). To zvyšuje aktivitu p53 stejným způsobem, jako komplex p53-MDM-2-Rb zvyšuje funkci p53 a je proapoptotický. Podrobný nedávný přehled osy p53-Rb-E2F1 viz Yamasaki (2003).

Část aktivace proteinu p53 zahrnuje fosforylaci proteinu p53 na seriny umístěné ve zbytcích 33 a 46 kináza p38 MAP (obrázek 5). Tato kináza p38 MAP je sama aktivována fosforylací (regulovanou cestou Ras-Raf-Mek-Erk), kterou lze reverzovat nebo inaktivovat fosfatázou Wip-1. Wip-1 je gen reagující na p53 nebo regulovaný na p53, který tvoří negativní autoregulační smyčku a spojuje dráhy p53 a Ras (Takekawa et al., 2000) (obrázek 5). Aktivovaný protein p53 pozitivně reguluje transkripci ubikvitin ligázy Siah-1 (Fiucci et al., 2004), která zase degraduje protein beta-katenin (Iwai et al., 2004) (obrázek 6). Hladiny beta-kateninu mohou regulovat gen ARF p14 / 19, což zase negativně reguluje MDM-2 a vede k vyšším hladinám p53 (smyčka pozitivní zpětné vazby) (obrázek 6). Siah-1 tedy spojuje cestu Wnt-beta-katenin-APC s cestou p53. V některých typech buněk indukuje protein p53 transkripci genu PTEN (obrázek 7). PTEN protein je PIP-3 fosfatáza. PIP-3 aktivuje AKT kinázu, která má řadu antiapoptotických proteinových substrátů včetně proteinu MDM-2. Fosforylace vede k translokaci MDM-2 do jádra, kde inaktivuje p53 (obrázek 7). To spojuje dráhu p53 s dráhou IGF-1-AKT a vytváří smyčku pozitivní zpětné vazby pro zvýšenou aktivitu p53 a sníženou aktivitu AKT. Tato smyčka v regulaci p53 byla také nedávno přezkoumána (Gottlieb et al., 2002). Tyto smyčky pozitivní a negativní zpětné vazby dosahují dvou věcí: (1) modulují aktivitu p53 v buňce a (2) koordinují aktivitu p53 s dalšími signálními transdukčními cestami, které regulují vstup buňky do buněčného cyklu (Rb-E2F-1, aktivity myc, Ras, beta-katenin, IGF-1 a cyklin E-cdk2).

Existují dva další autoregulační obvody p53, které negativně ovlivňují funkci p53. Jedním z nejaktivnějších z genů reagujících na p53 je gen pro cyklin G. Rychle se přepisuje na vysoké hladiny po aktivaci p53 v široké škále buněčných typů (Okamoto a Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). Protein cyklinu G tvoří komplex s PP2A fosfatázou, která odstraňuje fosfátový zbytek z MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (obrázek 8), který je přidán k proteinu MDM-2 pomocí cdk kinázy (Zhang a Prives, 2001) (obrázek 4). Fosforylace MDM-2 cyklinem A / cdk2 inhibuje jeho aktivitu, takže fosfatáza cyklinu G-PP2A zvyšuje aktivitu MDM-2 a inhibuje p53. Myši s vyřazeným genem pro cyklin G jsou životaschopné (Kimura et al., 2001) a fibroblasty myší s nulovým cyklem G bez embryí mají zvýšené hladiny proteinu p53 bez stresu (Okamoto et al., 2002), což dokazuje, že tato zpětnovazebná smyčka je funkční in vivo a působí na bazální hladiny p53 v buňce nejen na vyšší hladiny aktivované p53 po stresu. Druhá smyčka negativní zpětné vazby zahrnuje člena rodiny p53 transkripčních faktorů, které zahrnují p53, p63 a p73, které jsou příbuzné strukturou a funkcí a vyvinuly se ze společného předchůdce. Po stresové reakci se aktivuje gen p53, který následně stimuluje transkripci konkrétní sestřihové m-RNA z genu p73, nazývaného p73 delta N (obrázek 9). To překládá protein p73 bez jeho amino-terminální domény. Všechny tři rodiny proteinů p53 mají podobné doménové struktury složené z N-terminální transkripční aktivační domény spojené s doménou centrálního jádra, která se váže na specifickou sekvenci DNA diskutovanou výše. Všechny tři transkripční faktory rodiny p53 rozpoznávají stejnou sekvenci DNA, přestože p53, p63 a p73 jsou schopné iniciovat odlišné transkripční programy. Existuje však velké množství běžných genů, které lze regulovat všemi třemi proteiny, jak bylo nedávno přezkoumáno v Harms et al. (2004).Když tedy p53 aktivuje transkripci p73 delta N, může se protein p73 delta N vázat na mnoho genů regulovaných p53, ale absence transaktivační domény způsobí, že působí jako represor nebo kompetitor aktivace transkripce p53. Tímto způsobem je vytvořena smyčka negativní zpětné vazby a aktivita p53 klesá (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (obrázek 9). Pět z těchto pozitivních nebo negativních zpětnovazebních obvodů (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) tedy zahrnuje geny a proteiny, které jsou ústředními členy jiných signálních transdukčních drah, zatímco dva (cyklin G a p73 delta N) tvoří smyčky přímé negativní zpětné vazby.

Konečné smyčky negativní zpětné vazby, o nichž se bude diskutovat, přicházejí ve formě ubikvitinových ligáz. Překvapivě se zdá, že existují tři různé aktivity p53-ubiqutin ligázy (MDM-2, Cop-1 a Pirh-1), z nichž každá tvoří autoregulační smyčku vedoucí k nižší aktivitě p53 (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (obrázek 10). Každý gen je transkripčně aktivován p53. Proč je tato úroveň nadbytečnosti v současné době nejasná. Existuje několik možností, že tyto genové produkty jsou exprimovány nebo působí optimálně v různých typech buněk nebo tkání nebo dokonce v různých stádiích vývoje. Například myš s knock-outem MDM-2 je smrtelná asi 6 dní po oplodnění, právě při implantaci blastocysty. To může být spuštěno hypoxií, která se musí v této fázi objevit, aktivací p53 v nepřítomnosti MDM-2 a vyvoláním apoptózy. V souladu s touto interpretací je pozorování, že myš s dvojitým knockoutem p53, MDM-2 je životaschopná a rodí se normálně jako myš s knockoutem p53 (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). To je tedy v souladu s myšlenkou, že protein MDM-2 působí bez záložní aktivity ubikvitin ligázy ve stadiu blastocysty, ale tyto další proteiny mohou v pozdějších stádiích vývoje umožnit normálnější funkci. Tyto nápady jsou nyní testovatelné. Je také možné, že jedna nebo více z těchto tří ubikvitinových ligáz se podílí na udržování hladin p53 v nestresovaném nebo bazálním stavu, zatímco jiné působí až po produkci p53 vyvolaného stresem. Aktivovaný protein p53 a proteiny p53 vyvolané stresem mají velmi odlišné modifikace proteinů a jejich dopad na aktivitu MDM-2, Cop-1 nebo Pirh-2 je v současné době nejasný. Je pravděpodobné, že každá z těchto tří ubikvitinových ligáz tvoří proteinové komplexy v buňce a přidružené proteiny se mohou u každé z těchto ligáz dobře lišit a spojovat je s různými regulačními obvody. V současné době je o MDM-2 známo mnoho a relativně málo pozornosti bylo věnováno roli Cop-1 a Pirh-2, které byly v literatuře popsány pouze v uplynulém roce. Navíc se velmi nedávno ukázalo, že p53 je substrátem ještě dalšího enzymu E3 ubikvitin ligázy, topors (Rajendra et al., 2004). Zbývá určit, zda topors je také transkripčním cílem p53, a proto by měl být přidán do rostoucího seznamu proteinů přispívajících k autoregulační kontrole dráhy p53. Těchto otázek by se mělo zabývat několik příštích let studia.

Jak již bylo zmíněno výše, mnoho regulačních smyček zahrnuje MDM-2, což zdůrazňuje centrální roli MDM-2 při kontrole aktivity p53. Genetická analýza mutací p53 a MDM-2, které blokují tento proteinový komplex, identifikovala v každém proteinu kritické aminokyselinové zbytky, které jsou důležité pro tuto vazebnou interakci (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Bylo prokázáno, že stejné aminokyselinové zbytky navazují tyto proteinové kontakty v krystalové struktuře amino-konce HDM-2 (lidský protein) a peptidu z amino-konce p53 (Kussie et al., 1996). . Zbytky fenyalanin 19, tryptofan 23 a leucin 26 p53 tvoří hlavní kontakty v hydrofobní kapse MDM-2. Fosforylace zbytků serinu 20 a případně serinu 15 by měla tyto kontakty oslabit a peptidy a léky, které s těmito kontakty soutěží, blokují komplex p53 MDM-2 a podporují apoptózu v buňkách (Klein a Vassilev, 2004). Komplex p53-MDM-2 a aktivita ubikvitinové ligázy MDM-2 se tedy staly hlavním cílem léku u některých druhů rakoviny. U přibližně třetiny lidských sarkomů a u některých leukémií a glioblastomů byl gen HDM-2 amplifikován a tento protein je nadměrně exprimován. Gen p53 je divokého typu a protein p53 je zjevně neaktivní, takže léky, které rozbíjejí komplex p53-HDM-2, by měly aktivovat p53. Navíc se zdá, že mnoho dalších druhů rakoviny exprimuje produkt genu HDM-2 na vysokých úrovních, i když gen HDM-2 není amplifikován. U těchto typů rakoviny by blokování aktivity HDM-2 nebo uvolňování p53 z tohoto komplexu mohlo dobře vyvolat apoptózu selektivně v rakovinných buňkách. To by také mohlo zvýšit chemoterapeutickou aktivitu některých léků, které aktivují p53.

Předpokládá se, že autoregulační smyčka p53-MDM-2 nastaví oscilátor s úrovněmi p53 a MDM-2, které se zvyšují a snižují s časem a mimo fázi v buňce. To bylo nejprve prokázáno měřením hladin MDM-2 a p53 pomocí Western blotů proteinů z buněk v kultuře, která prochází stresovou odpovědí p53 (Lev Bar-Or et al., 2000). I když jsou oscilace pozorovány a časem tlumeny, tento experiment zprůměruje koncentrace proteinů z mnoha buněk v kultuře, které mohou být mimo jejich oscilace, což vede ke konstruktivní nebo destruktivní interferenci. Z tohoto důvodu byly fluorescenčně značené fúzní proteiny p53 a HDM2 zobrazeny v jednotlivých buňkách, aby sledovaly změny v hladinách p53 a HDM-2 v buňkách podstupujících stresovou reakci p53. Byly pozorovány očekávané oscilace mimo fázi a překvapivě byl počet oscilací v buňce úměrný dávce záření danému těmto buňkám (Lahav et al., 2004). To naznačuje, že p53 může měřit intenzitu stresového signálu digitálním způsobem (počet oscilací) a nikoli analogickým způsobem (vyšší koncentrace p53). Podobné oscilace byly pozorovány u jiných signálních transdukčních drah, které mají negativní autoregulační smyčky, jako je NF-kB dráha s proteiny NF-kB-I a I-kB-B (Scott et al., 1993). Tyto digitální signály, které jsou výsledkem oscilací v množství transkripčních faktorů, by mohly dobře vést ke vzoru periodické genové exprese. Jak však jsou digitální signály na úrovni transkripčního faktoru převedeny do analogových signálů na úrovni množství mRNA produkované genem, zůstává nejasné. Tyto experimenty vedou k možnosti, že různé počty oscilací, načasování nebo vlnová délka oscilací nebo amplituda těchto oscilací mohou ovlivnit vybraný vzorec genové exprese a výsledek (zástava buněčného cyklu, apoptóza nebo senescence) p53 odpověď.

Proč je v cestě p53 tolik smyček zpětné vazby? Na tuto otázku existuje mnoho odpovědí. Všechny mechanismy nemusí být aktivní ve stejném typu buňky nebo tkáně nebo ve stejných stádiích během vývoje. Smyčky zpětné vazby zde popsaného typu poskytují prostředky pro propojení dráhy p53 s jinými drahami přenosu signálu a koordinaci buněčných signálů pro růst a dělení. Redundance v systému mohou někdy zabránit chybám a záložní systém snižuje fenotyp mutací. Na druhou stranu, ne každá ze zpětnovazebních smyček zobrazených na obrázcích 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 a 10 může obstát ve zkoušce času a dalších experimentech. Mnoho z těchto cest bylo objasněno experimenty prováděnými s rakovinovými buňkami v kultuře, které mají mutace, které tyto cesty mění. Dokonce ani normální buňky v kultuře nebo knockoutované myši (kvůli přizpůsobení mutaci) nemusí odrážet všechny podmínky, které se vyskytují v normálních buňkách a orgánech in vivo. Je obzvláště obtížné prokázat, že specifická proteinová kináza nebo fosfatáza působí na specifický substrát in vivo a má výsledek, který lze měřit kvantitativně. Musíme tedy nadále testovat a zpochybňovat funkce a cesty, o nichž se domníváme, že fungují v buňce. Tyto konstrukty, zobrazené na obrázcích 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 a 10, jsou však užitečné při formulování hypotéz a testování myšlenek, které jistě povedou k novým poznatkům o povaze rakoviny a designu léků a látky, které selektivně ničí rakovinné buňky.