Der p53-Weg: positive und negative Rückkopplungsschleifen

In verschiedenen Studien in der Literatur wurden 10 positive oder negative Rückkopplungsschleifen im p53-Weg identifiziert (siehe Abbildungen 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10). Jede dieser Schleifen erzeugt einen Kreislauf, der aus Proteinen besteht, deren Aktivitäten oder Syntheseraten durch die Aktivierung von p53 beeinflusst werden, was wiederum zu einer Veränderung der p53-Aktivität in einer Zelle führt. Davon sind sieben negative Rückkopplungsschleifen, die die p53-Aktivität herabsetzen (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73-Delta N, Cyclin G, Wip-1 und Siah-1), und drei sind positive Rückkopplungsschleifen (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF und Rb), die die p53-Aktivität modulieren. Alle diese Netzwerke oder Schaltkreise sind insofern autoregulatorisch, als sie entweder durch p53-Aktivität auf Transkriptionsebene induziert, durch p53 (p14 / 19 ARF, 3) transkriptionell unterdrückt oder durch p53-induzierte Proteine reguliert werden. Sechs dieser Rückkopplungsschleifen wirken durch MDM-2 (MDM-2, Cyclin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT und Rb), um die p53-Aktivität zu modulieren.

Ein aufregender Befund ist, dass der p53-Pfad eng mit anderen Signaltransduktionen verbunden ist Wege, die eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Krebs spielen. Eine der ersten untersuchten Verbindungen betrifft p14 / p19ARF und MDM-2. Das p14 / 19-ARF-Protein bindet an das MDM-2-Protein und moduliert dessen Ubiquitin-Ligase-Aktivität, wodurch die Spiegel des p53-Proteins erhöht werden (Honda und Yasuda, 1999) (3). Die Transkription des p14 / 19-ARF-Gens wird durch E2F-1 (Zhu et al., 1999) und Beta-Catenin (Damalas et al., 2001) positiv reguliert und durch p53 selbst negativ reguliert. Zusätzlich werden die Spiegel von p14 / 19-ARF-Protein durch Ras- und Myc-Aktivitäten in einer Zelle erhöht (3). Die Komplexität der Regulation von p53 durch p14 / p19 ARF wurde kürzlich überprüft (Lowe und Sherr, 2003). Die p14 / 19-ARF-MDM-2-Komplexe sind aufgrund der in p14 / p19-ARF vorhandenen nukleolaren Lokalisierungssignale häufig im Nucleolus der Zelle lokalisiert. Der Nucleolus ist der Ort der ribosomalen Biogenese, und die p14 / 19-ARF-Aktivität selbst kann die Geschwindigkeit der RNA-Verarbeitung des ribosomalen RNA-Vorläufers zu reifen ribosomalen Untereinheiten verändern (Sugimoto et al., 2003). Daher spielt p14 / 19-ARF durch Kontrolle der MDM-2- und p53-Spiegel und deren Koordination mit der ribosomalen Biogenese eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellzyklus. Dies wurde kürzlich durch den Nachweis verstärkt, dass das p14 / 19-ARF-Protein auch die Myc-Aktivität (und damit die Zellgröße) regulieren kann (Datta et al., 2004). Das MDM-2 im Nucleolus ist jedoch keine passive Einheit. Es wurde gezeigt, dass das MDM-2-Protein spezifisch an drei große Proteine der ribosomalen Untereinheit L5, L11 und L23 bindet (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004) ) und die Bindung von L5 (Dai und Lu, 2004) oder L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) an MDM-2 senkt seine Ubiquitin-Ligase-Aktivität. Zusätzlich bindet die Ringfinger-Domäne von MDM-2 spezifisch an eine RNA-Sequenz, die in der großen ribosomalen RNA-Untereinheit gefunden wird (Elenbaas et al., 1996). Während all diese Beobachtungen auf eine zentrale Rolle von MDM-2 und p14 / 19 ARF bei der Regulation der Ribosomenbiogenese und des Zellzyklus hinweisen, verstehen wir nicht, wie diese Beobachtungen zusammenkommen, um diesen Regelkreis zu bilden.

Das Rb-Protein kann in Zellen in einem Komplex mit MDM-2 und p53 gefunden werden, was zu einer hohen p53-Aktivität und einer erhöhten apoptotischen Aktivität führt (Xiao et al., 1995). Hohe Konzentrationen an aktivem E2F-1, das nicht an Rb gebunden ist, schalten die p53-Antwort vom G-1-Arrest auf Apoptose um. Sowohl Rb als auch MDM-2 werden durch Cyclin E-cdk2 phosphoryliert und inhibiert (Abbildung 4). Wenn p53 aktiviert wird, stimuliert es die Synthese des p21-Proteins, das die Cyclin E-cdk2-Aktivität hemmt, und dies wirkt wiederum auf den Rb-MDM-2-Komplex, der die p53-Aktivität und Apoptose fördert. Nach einer DNA-Schädigung werden sowohl das MDM-2-Protein als auch das p53-Protein durch die ATM-Proteinkinase modifiziert (4). Dies erhöht die p53-Aktivität auf die gleiche Weise, wie der p53-MDM-2-Rb-Komplex die p53-Funktion erhöht und proapoptotisch ist. Für eine detaillierte aktuelle Übersicht über die p53-Rb-E2F1-Achse siehe Yamasaki (2003).

Ein Teil der Aktivierung des p53-Proteins beinhaltet die Phosphorylierung des p53-Proteins an Serinen, die sich an den Resten 33 und 46 befinden die p38-MAP-Kinase (5). Diese p38-MAP-Kinase wird selbst durch Phosphorylierung (reguliert durch den Ras-Raf-Mek-Erk-Weg) aktiviert, die durch die Wip-1-Phosphatase umgekehrt oder inaktiviert werden kann. Wip-1 ist ein auf p53 ansprechendes oder auf p53 reguliertes Gen, das eine negative autoregulatorische Schleife bildet und die p53- und Ras-Wege verbindet (Takekawa et al., 2000) (5). Ein aktiviertes p53-Protein reguliert positiv die Transkription der Ubiquitin-Ligase Siah-1 (Fiucci et al., 2004), die wiederum das Beta-Catenin-Protein abbaut (Iwai et al., 2004) (6). Beta-Catenin-Spiegel können das p14 / 19-ARF-Gen regulieren, was wiederum MDM-2 negativ reguliert und zu höheren p53-Spiegeln führt (eine positive Rückkopplungsschleife) (6). Siah-1 verbindet somit den Wnt-Beta-Catenin-APC-Weg mit dem p53-Weg. In einigen Zelltypen induziert das p53-Protein die Transkription des PTEN-Gens (7). Das PTEN-Protein ist eine PIP-3-Phosphatase. PIP-3 aktiviert die AKT-Kinase, die eine Reihe von antiapoptotischen Proteinsubstraten einschließlich des MDM-2-Proteins aufweist. Die Phosphorylierung führt zur Translokation von MDM-2 in den Kern, wo es p53 inaktiviert (Abbildung 7). Dies verbindet den p53-Weg mit dem IGF-1-AKT-Weg und bildet eine positive Rückkopplungsschleife für eine erhöhte p53-Aktivität und eine verringerte AKT-Aktivität. Diese Schleife in der p53-Regulation wurde kürzlich ebenfalls überprüft (Gottlieb et al., 2002). Diese positiven und negativen Rückkopplungsschleifen bewirken zwei Dinge: (1) sie modulieren die p53-Aktivität in der Zelle und (2) sie koordinieren die p53-Aktivität mit anderen Signaltransduktionswegen, die den Eintritt der Zelle in den Zellzyklus regulieren (Rb-E2F-1, myc-, Ras-, Beta-Catenin-, IGF-1- und Cyclin-E-cdk2-Aktivitäten).

Es gibt zwei zusätzliche autoregulatorische p53-Schaltkreise, die sich negativ auf die p53-Funktion auswirken. Eines der aktivsten der auf p53 ansprechenden Gene ist das Cyclin G-Gen. Es wird nach p53-Aktivierung in einer Vielzahl von Zelltypen schnell auf hohe Spiegel transkribiert (Okamoto und Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). Das Cyclin G-Protein bildet einen Komplex mit der PP2A-Phosphatase, die einen Phosphatrest aus MDM-2 entfernt (Okamoto et al., 2002) (8), der dem MDM-2-Protein durch eine cdk-Kinase (Zhang und Prives, 2001) (Abbildung 4). Die Phosphorylierung von MDM-2 durch Cyclin A / cdk2 hemmt seine Aktivität, daher erhöht die Cyclin G-PP2A-Phosphatase die MDM-2-Aktivität und hemmt p53. Mäuse mit ausgeschaltetem Cyclin G-Gen sind lebensfähig (Kimura et al., 2001), und Cyclin G-Null-Mausembryofibroblasten haben in Abwesenheit von Stress erhöhte p53-Proteinspiegel (Okamoto et al., 2002), was zeigt, dass diese Rückkopplungsschleife ist in vivo operativ und wirkt auf die Grundwerte von p53 in einer Zelle, nicht nur auf die höheren aktivierten p53-Werte nach Stress. Die zweite negative Rückkopplungsschleife betrifft ein Mitglied der p53-Familie von Transkriptionsfaktoren, zu denen p53, p63 und p73 gehören, die durch Struktur und Funktion verwandt sind und sich aus einem gemeinsamen Vorläufer entwickelt haben. Nach einer Stressreaktion wird das p53-Gen aktiviert, was wiederum die Transkription einer bestimmten gespleißten m-RNA aus dem p73-Gen, genannt p73-Delta N, stimuliert (Abbildung 9). Dies übersetzt ein p73-Protein ohne seine aminoterminale Domäne. Alle drei Proteine der p53-Familie weisen ähnliche Domänenstrukturen auf, die aus einer N-terminalen Transkriptionsaktivierungsdomäne bestehen, die an eine zentrale Kerndomäne gebunden ist, die an eine oben diskutierte spezifische DNA-Sequenz bindet. Alle drei Transkriptionsfaktoren der p53-Familie erkennen dieselbe DNA-Sequenz, obwohl p53, p63 und p73 unterschiedliche Transkriptionsprogramme initiieren können. Es gibt jedoch eine große Anzahl gemeinsamer Gene, die von allen drei Proteinen reguliert werden können, wie kürzlich in Harms et al. (2004).Wenn p53 die Transkription von p73-Delta-N aktiviert, kann das p73-Delta-N-Protein an viele der p53-regulierten Gene binden, aber das Fehlen einer Transaktivierungsdomäne bewirkt, dass es als Repressor oder Konkurrent der p53-Transkriptionsaktivierung wirkt. Auf diese Weise wird eine negative Rückkopplungsschleife aufgebaut und die p53-Aktivität nimmt ab (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (9). Somit umfassen fünf dieser positiven oder negativen Rückkopplungsschaltungen (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) Gene und Proteine, die zentrale Mitglieder anderer Signalübertragungswege sind, während zwei (Cyclin G und p73 Delta) N) bilden direkte negative Rückkopplungsschleifen.

Die letzten zu diskutierenden negativen Rückkopplungsschleifen liegen in Form von Ubiquitin-Ligasen vor. Überraschenderweise scheint es drei verschiedene p53-Ubiqutin-Ligase-Aktivitäten (MDM-2, Cop-1 und Pirh-1) zu geben, von denen jede eine autoregulatorische Schleife bildet, die zu einer geringeren p53-Aktivität führt (Leng et al., 2003; Dornan et al ., 2004) (10). Jedes Gen wird durch p53 transkriptionell aktiviert. Warum es diesen Redundanzgrad gibt, ist derzeit unklar. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, dass diese Genprodukte in verschiedenen Zell- oder Gewebetypen oder sogar in verschiedenen Entwicklungsstadien exprimiert werden oder optimal wirken. Beispielsweise ist die MDM-2-Knockout-Maus etwa 6 Tage nach der Befruchtung unmittelbar nach der Implantation der Blastozyste tödlich. Dies kann durch die Hypoxie ausgelöst werden, die in diesem Stadium auftreten muss, p53 in Abwesenheit von MDM-2 aktiviert und Apoptose verursacht. In Übereinstimmung mit dieser Interpretation ist die Beobachtung, dass eine p53, MDM-2-Doppelknockout-Maus lebensfähig ist und so normal wie eine p53-Knockout-Maus geboren wird (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Dies steht daher im Einklang mit der Vorstellung, dass das MDM-2-Protein im Blastozystenstadium ohne Backup-Ubiquitin-Ligase-Aktivität wirkt, diese anderen Proteine jedoch möglicherweise in späteren Entwicklungsstadien eine normalere Funktion ermöglichen. Diese Ideen sind jetzt überprüfbar. Es ist auch möglich, dass eine oder mehrere dieser drei Ubiquitin-Ligasen an der Aufrechterhaltung der p53-Spiegel im nicht gestressten oder basalen Zustand beteiligt sind, während andere erst wirken, nachdem ein stressinduziertes p53 produziert wurde. Das aktivierte p53- und das stressinduzierte p53-Protein weisen sehr unterschiedliche Proteinmodifikationen auf, und der Einfluss davon auf die Aktivität von MDM-2, Cop-1 oder Pirh-2 ist derzeit unklar. Es ist wahrscheinlich, dass jede dieser drei Ubiquitin-Ligasen Proteinkomplexe in der Zelle bildet und die assoziierten Proteine sich für jede dieser Ligasen unterscheiden können, wodurch sie mit verschiedenen Regulationskreisläufen verbunden werden. Gegenwärtig ist viel über MDM-2 bekannt, und es wurde relativ wenig Wert auf die Rolle von Cop-1 und Pirh-2 gelegt, über die erst im letzten Jahr oder so in der Literatur berichtet wurde. Zusätzlich wurde kürzlich gezeigt, dass p53 das Substrat eines weiteren E3-Ubiquitin-Ligase-Enzyms ist, Toporen (Rajendra et al., 2004). Es bleibt zu bestimmen, ob Toporen auch ein Transkriptionsziel von p53 sind und daher in die wachsende Liste der Proteine aufgenommen werden sollten, die zur autoregulatorischen Kontrolle des p53-Weges beitragen. Die nächsten Studienjahre sollten sich mit diesen Fragen befassen.

Wie oben erwähnt, betreffen viele der Regelkreise MDM-2, wodurch die zentrale Rolle von MDM-2 bei der Kontrolle der p53-Aktivität hervorgehoben wird. Eine genetische Analyse von p53- und MDM-2-Mutationen, die diesen Proteinkomplex blockieren, hat kritische Aminosäurereste in jedem Protein identifiziert, die für diese Bindungswechselwirkung wichtig sind (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Es wurde gezeigt, dass dieselben Aminosäurereste diese Proteinkontakte in der Kristallstruktur des Amino-Terminus von HDM-2 (dem menschlichen Protein) und eines Peptids vom Amino-Terminus von p53 herstellen (Kussie et al., 1996). . Die Reste Phenyalanin 19, Tryptophan 23 und Leucin 26 von p53 bilden die Hauptkontakte in der hydrophoben MDM-2-Tasche. Die Phosphorylierung der Reste Serin 20 und möglicherweise Serin 15 sollte diese Kontakte schwächen, und Peptide und Arzneimittel, die mit diesen Kontakten konkurrieren, blockieren den p53-MDM-2-Komplex und fördern die Apoptose in Zellen (Klein und Vassilev, 2004). Somit sind der p53-MDM-2-Komplex und die MDM-2-Ubiquitin-Ligase-Aktivität zu einem Hauptarzneimittelziel für einige Krebsarten geworden. Bei etwa einem Drittel der menschlichen Sarkome und bei einigen Leukämien und Glioblastomen wurde das HDM-2-Gen amplifiziert und dieses Protein wird überexprimiert. Das p53-Gen ist ein Wildtyp und das p53-Protein ist offensichtlich inaktiv, so dass Arzneimittel, die den p53-HDM-2-Komplex brechen, p53 aktivieren sollten. Darüber hinaus scheinen viele andere Krebsarten das HDM-2-Genprodukt in hohen Konzentrationen zu exprimieren, selbst wenn das HDM-2-Gen nicht amplifiziert wird. Bei diesen Krebsarten könnte die Blockierung der HDM-2-Aktivität oder die Freisetzung von p53 aus diesem Komplex die Apoptose in den Krebszellen selektiv induzieren. Dies könnte auch die chemotherapeutische Aktivität einiger Arzneimittel verbessern, die p53 aktivieren.

Es wird vorausgesagt, dass die autoregulatorische p53-MDM-2-Schleife einen Oszillator aufbaut, dessen p53- und MDM-2-Pegel mit der Zeit zunehmen und abnehmen und in der Zelle phasenverschoben sind. Dies wurde zuerst durch Messen der MDM-2- und p53-Spiegel unter Verwendung von Western Blots von Proteinen aus Zellen in Kultur gezeigt, die eine p53-Stressantwort durchlaufen (Lev Bar-Or et al., 2000). Während Oszillationen beobachtet und mit der Zeit gedämpft werden, mittelt dieses Experiment die Proteinkonzentrationen vieler Zellen in Kultur, die in ihren Oszillationen phasenverschoben sein können, was zu konstruktiven oder destruktiven Interferenzen führt. Aus diesem Grund wurden fluoreszenzmarkierte p53- und HDM2-Fusionsproteine in einzelnen Zellen abgebildet, um den Änderungen der p53- und HDM-2-Spiegel in Zellen zu folgen, die eine p53-Stressantwort durchlaufen. Die erwarteten phasenverschobenen Schwingungen wurden beobachtet und überraschenderweise war die Anzahl der Schwingungen in einer Zelle proportional zur Strahlungsdosis, die diesen Zellen verabreicht wurde (Lahav et al., 2004). Dies legt nahe, dass p53 die Intensität eines Spannungssignals auf digitale Weise (Anzahl der Schwingungen) und nicht auf analoge Weise (höhere p53-Konzentrationen) messen kann. Ähnliche Oszillationen wurden bei anderen Signaltransduktionswegen beobachtet, die negative autoregulatorische Schleifen aufweisen, wie dem NF-κ-B-Weg mit den NF-κ-B- und I-κ-B-Proteinen (Scott et al., 1993). Diese digitalen Signale, die aus Schwankungen in der Menge der Transkriptionsfaktoren resultieren, könnten durchaus zu einem Muster der periodischen Genexpression führen. Es bleibt jedoch unklar, wie digitale Signale auf der Ebene des Transkriptionsfaktors in analoge Signale auf der Ebene der von einem Gen produzierten mRNA-Menge übersetzt werden. Diese Experimente führen zu der Möglichkeit, dass eine unterschiedliche Anzahl von Schwingungen, der Zeitpunkt oder die Wellenlänge der Schwingungen oder die Amplitude dieser Schwingungen das ausgewählte Muster der Genexpression und das Ergebnis (Zellzyklusstillstand, Apoptose oder Seneszenz) des p53 beeinflussen können Antwort.

Warum gibt es so viele Rückkopplungsschleifen im p53-Pfad? Auf diese Frage gibt es viele Antworten. Möglicherweise sind nicht alle Mechanismen in demselben Zell- oder Gewebetyp oder in denselben Stadien während der Entwicklung aktiv. Rückkopplungsschleifen des hier beschriebenen Typs bieten ein Mittel, um den p53-Weg mit anderen Signalübertragungswegen zu verbinden und die zellulären Signale für Wachstum und Teilung zu koordinieren. Redundanzen in einem System können manchmal Fehler verhindern und ein Backup-System reduziert den Phänotyp von Mutationen. Andererseits kann nicht jede der in den 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 gezeigten Rückkopplungsschleifen den Test der Zeit und weitere Experimente bestehen. Viele dieser Wege wurden durch Experimente mit Krebszellen in Kultur aufgeklärt, die Mutationen aufweisen, die diese Wege verändern. Selbst normale Zellen in Kultur- oder Knockout-Mäusen (aufgrund der Anpassung an die Mutation) spiegeln möglicherweise nicht alle Bedingungen wider, die in vivo in normalen Zellen und Organen auftreten. Es ist besonders schwierig nachzuweisen, dass eine bestimmte Proteinkinase oder Phosphatase in vivo auf ein bestimmtes Substrat einwirkt und ein Ergebnis hat, das quantitativ gemessen werden kann. Daher müssen wir weiterhin die Funktionen und Wege testen und herausfordern, von denen wir glauben, dass sie in einer Zelle funktionieren. Diese in den 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 gezeigten Konstrukte sind jedoch nützlich, um Hypothesen zu formulieren und Ideen zu testen, die sicherlich zu neuen Einsichten in die Natur von Krebs und das Design von Arzneimitteln und Krebs führen werden Mittel, die selektiv Krebszellen abtöten.