Eine vergleichende phänotypische und genomische Analyse von C57BL / 6J- und C57BL / 6N-Mausstämmen

Genomsequenzvergleiche von C57BL / 6N- und C57BL / 6J-Mäusen auf SNPs und kleine Indels

Wir verwendeten das Paired-End-Alignment von C57BL / 6N zum Referenzgenom (C57BL / 6J) aus dem 17 Mouse Genomes Project. Die Liste der differenzierenden Varianten (SNPs, Small Indels und SVs) zwischen den beiden Genomen wurde jedoch unter Verwendung neuartiger eingebauter Verfahren neu erstellt, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, genaue mutmaßliche Sequenzänderungen zu identifizieren. Ein wichtiger Analyseschritt bei der Identifizierung eines qualitativ hochwertigen Satzes von Varianten aus dem Alignment war die Verwendung der neu erzeugten kurz gelesenen Genomsequenz von C57BL / 6J, die vom Broad Institute erzeugt wurde. Dies ermöglichte es uns, Montagefehler in der Referenzsequenz zu identifizieren. Darüber hinaus haben wir die Methode zur Erkennung von Varianten aktualisiert: Erstens durch Verwendung unterschiedlicher und / oder weiterentwickelter Software zur Erkennung von Varianten; zweitens durch manuelle Kuration aller Codierungsvarianten und drittens durch umfassende Validierung eines großen Teils der Varianten (einschließlich aller Codierungsvarianten), um die Sequenzvorhersagen zu bestätigen. Diese Schritte lieferten einen robusten Datensatz hochwertiger Codierungsvarianten, wodurch die Falsch-Positiv-Rate erheblich reduziert wurde.

Um SNPs und kleine Indels zu identifizieren, die die C57BL / 6J- und C57BL / 6N-Stämme unterscheiden, verwendeten wir die gepaarten End Reads, die aus dem 17 Mouse Genomes Project generiert wurden. Wir haben Varianten mit dem Genome Analysis Toolkit (GATK) aufgerufen und 681.220 Varianten gefunden, die die Stämme C57BL / 6J und C57BL / 6N unterscheiden. Unter Verwendung der vom Broad Institute erzeugten kurz gelesenen Genomsequenz von C57BL / 6J konnten wir potenzielle Sequenzierungsfehler herausfiltern, indem wir Varianten entfernten, die für die Broad C57BL / 6J-Sequenz typisch sind, und so Diskrepanzen in der Referenz entgegenwirken und gleichzeitig das falsch-negative Ergebnis verbessern Bewertung. Die verbleibenden Lesevorgänge wurden mit einem Allelverhältnis von weniger als 0,8 (heterozygot) gefiltert und von weniger als 3 oder mehr als 150 Lesevorgängen abgedeckt. Diese Schritte reduzierten die Liste erheblich und führten zu 10.794 mutmaßlichen Varianten, die weiteren Analysen unterzogen wurden.

Mit Sequenom-, PyroSequencing- und Sanger-Sequenzierung validierten wir alle Codierungsvarianten und eine Teilmenge der nichtcodierenden Varianten. Darunter waren 762 SNPs und 169 kleine Indels. Die Assays wurden unter Verwendung eines Panels von vier C57BL / 6J- und vier C57BL / 6N-Proben durchgeführt, um Genotypen zu bestätigen (siehe Materialien und Methoden). Wir betrachteten eine Variante als validiert, wenn alle vier C57BL / 6J- und C57BL / 6N-Proben konsistente Genotypen innerhalb eines Teilstamms und Varianten zwischen den Teilstämmen zeigten. Während des Validierungsprozesses haben wir aus einer Reihe von Gründen 363 Varianten eliminiert, darunter heterozygote und inkonsistente Genotypen und PCR-Fehler. Für die verbleibenden 568 wurden 236 als Variante zwischen den Substämmen bestätigt (siehe Zusätzliche Datei 1, Tabelle S1).

Unter Verwendung der Annotationsprogramme NGS-SNP und Annovar wurden der genomische Ort und andere Genmerkmale ermittelt untersucht. Die endgültig validierten Sequenzvarianten zwischen C57BL / 6J und C57BL / 6N bestanden aus 34 codierenden SNPs, 2 codierenden kleinen Indels, 146 nicht codierenden SNPs und 54 nicht codierenden kleinen Indels. Codierungsvarianten umfassten 32 Missense-SNPs, 1 Nonsense-Mutation, 1 Spleißmutation und 2 Frameshift-Mutationen (Tabelle 1). Wir fanden heraus, dass alle Varianten außer einer (Zp2, Chromosom 7) entweder für C57BL / 6J oder C57BL / 6N privat waren und in keinem der 16 anderen kürzlich sequenzierten Inzuchtstämme gefunden wurden.

Genomsequenzvergleiche von C57BL / 6N- und C57BL / 6J-Mäusen für Strukturvarianten

Verwenden Sie erneut die aus dem 17 Mouse Genomes Project generierten Paired-End-Reads und eine Kombination aus vier Berechnungen Methoden identifizierten wir 551 SVs zwischen C57BL / 6J und C57BL / 6N. Wie an anderer Stelle beschrieben, untersuchten wir visuell die kurzgelesene Paired-End-Kartierung an diesen 551 SV-Stellen in den 17 sequenzierten Inzuchtstämmen von Mäusen und im sequenzierten Broad J-Genom. Auf diese Weise konnten wir 81 der 551 Stellen für weitere experimentelle Analysen behalten (470 vorhergesagte Stellen erwiesen sich aufgrund von Paired-End-Mapping-Fehlern als falsch). PCR- und Sanger-basierte Sequenzierungsanalysen an diesen 81 zurückgehaltenen Stellen ermöglichten es uns, weitere 38 Stellen zu entfernen, die aufgrund von Referenzfehlern zwischen C57BL / 6J und C57BL / 6N als nicht polymorph bestätigt wurden. Schließlich wurden alle 43 vorhergesagten Varianten als authentische SVs validiert, die die Stämme C57BL / 6J und C57BL / 6N unterschieden (Tabelle 2), was zu einer Null-Falsch-Positiv-Rate führte.

Von den 43 SVs überlappen 15 mit einem Gen (Tabelle 2), einschließlich 12 Varianten, die in nicht-kodierenden Regionen von Genen liegen, 2 Varianten, die die kodierende Region des Gens beeinflussen (Vmn2r65) (Vomeronasal 2, Rezeptor 65) und Nnt (Nicotinamid-Nucleotid-Transhydrogenase)) und 1, das das gesamte Gen Cyp2a22 (Cytochrom P450, Familie 2, Unterfamilie a, Polypeptid 22) betrifft. Nur 1 der 15 Varianten ist bekannt und wurde bereits mit einem Phänotyp, Nnt, assoziiert; Die restlichen 14 sind neu und für einige diskutieren wir ihre möglichen biologischen Funktionen weiter unten.

Unter Verwendung der Ratte als Fremdgruppenspezies folgerten wir als nächstes den Ursprung der 43 SVs zwischen C57BL / 6J und C57BL / 6N. und fanden heraus, dass 27 Varianten das Produkt der Retrotransposition waren, 15 nicht wiederholungsvermittelte SVs waren und 1 eine Tandem-Wiederholung mit variabler Anzahl (VNTR) war (Tabelle 2). Bemerkenswerterweise waren fast alle Varianten entweder für C57BL / 6J oder C57BL / 6N privat (Tabelle 2).

Umfassende phänotypische Bewertung von C57BL / 6N- und C57BL / 6J-Mäusen

parallel zu Bei den Genomanalysen hat das Konsortium der European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) einen umfassenden phänotypischen Vergleich der Stämme C57BL / 6NTac und C57BL / 6J durchgeführt. EUMODIC umfasst vier Mauszentren, die eine breit angelegte primäre Phänotypisierung von 500 Mausmutanten-Knockout-Linien durchführen, die aus den Projekten European Conditional Mouse Mutagenesis (EUCOMM) und Knockout Mouse (KOMP) im Rahmen des IKMC-Programms generiert wurden. Kohorten von Mäusen aus jeder Mutantenlinie werden in die EMPReSSslim-Phänotypbewertung (European Mouse Phenotyping Resource of Standardized Screens Slim) aufgenommen, die aus zwei Phänotypisierungspipelines besteht, die zusammen 20 Phänotypisierungsplattformen (identifiziert durch eine ESLIM__procedure_number) umfassen, die 9 bis 15 Wochen lang durchgeführt werden (siehe Zusätzliche Datei 2, Abbildung S1). Die Methoden zur Durchführung der einzelnen Bildschirme sind in den Standardarbeitsanweisungen (SOPs) beschrieben, die in der EMPReSS-Datenbank enthalten sind. Daten wurden zu 413 Phänotypparametern zusammen mit 146 Metadatenparametern erfasst und in die EuroPhenome-Datenbank eingegeben. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir umfangreiche Kontrolldaten zum Basisphänotyp von C57BL / 6NTac erfasst. Wir haben diese Gelegenheit auch genutzt, um den Phänotyp von C57BL / 6J-Mäusen zu untersuchen und diesen mit C57BL / 6NTac (im Folgenden als J bzw. N bezeichnet) zu vergleichen.

Für jede Linie N und J Alter Übereinstimmende Mäuse wurden durch beide EMPReSSslim-Pipelines analysiert. Von allen vier Zentren des Konsortiums wurden Daten für 19 der 20 Plattformen aus der Pipeline erfasst, ausgenommen fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalysen (FACS) (siehe Zusätzliche Datei 2, Abbildung S1). Die EMPReSSslim-Protokolle wurden im EUMODIC-Konsortium streng standardisiert. Es gibt jedoch noch einige Unterschiede, beispielsweise in Bezug auf Ausrüstung und Ernährung, die in den Metadatensätzen von EuroPhenome erfasst werden. Es wird natürlich auch andere nicht erkannte Umweltunterschiede zwischen den Zentren geben. Zusammengenommen können diese zu Unterschieden in der Genumgebung und zum Ergebnis des Phänotyps beitragen. Wir haben jedoch nicht versucht, diese Effekte systematisch zu definieren, sondern uns auf Phänotypen zu konzentrieren, die zwischen den Zentren übereinstimmen und eindeutig robust gegenüber nicht erkannten Umweltstörungen sind. Daten aus den N- und J-Kohorten jedes Zentrums wurden in EuroPhenome hinterlegt und für jedes Zentrum einer statistischen Analyse unterzogen (siehe Materialien und Methoden). Es ist wichtig anzumerken, dass Vergleiche zwischen N und J innerhalb und nicht zwischen Zentren durchgeführt wurden. Eine statistische Analyse der Ergebnisse zwischen den Zentren wurde nicht durchgeführt, da die Experimente zwischen den Zentren aufgrund von Umwelt- und anderen Variablen und Unterschieden in der Anzahl der in jedem Zentrum analysierten Tiere nicht vollständig kontrolliert werden konnten (siehe Zusätzliche Datei 3, Abbildung S2a-d). Wir haben uns daher für einen Ansatz entschieden, der sich auf Stammvergleiche innerhalb einzelner Zentren konzentriert, anstatt ein multizentrisches statistisches Modell zu erstellen, das einen statistischen Gesamtunterschied zwischen den beiden Stämmen untersucht. Die Replikation des N- und J-Vergleichs über mehrere Zentren hinweg lieferte uns jedoch zusätzliche Möglichkeiten, signifikante phänotypische Unterschiede zwischen den beiden Stämmen zu belegen. Neben der Analyse von N und J über die EMPReSSslim-Pipeline für die primäre Phänotypisierung in den vier Zentren haben andere Partner des EUMODIC-Konsortiums ein breiteres Spektrum häufig komplexerer Phänotypisierungstests angewendet, um zusätzliche Informationen zu sammeln, von denen einige weiter untersucht werden und darauf abzielen Begründen Sie die durch EMPReSSslim aufgedeckten phänotypischen Unterschiede.

Bei der Analyse der Daten konzentrierten wir uns zunächst auf die Identifizierung von Phänotypparametern, die in drei oder mehr Zentren einen konsistenten und signifikanten Unterschied zwischen N und J zeigten.Wir haben 27 Phänotypparameter in dieser Klasse identifiziert (Abbildung 1a; siehe Zusätzliche Datei 3, Abbildung S2a, e). In einigen Fällen wurden diese Unterschiede durch Daten aus der Sekundäranalyse gestützt, und wir diskutieren diese Fälle unten. Wir haben auch eine zweite Klasse von Parametern entdeckt, für die ähnliche Trends in zwei Zentren beobachtet wurden, in den beiden anderen Zentren jedoch keine Hinweise auf Trends (Abbildung 1b; siehe Zusätzliche Datei 3, Abbildung S2b, f). Unsere statistische Analyse (siehe Materialien und Methoden) zeigt jedoch, dass für diese Klasse von Parametern die Gesamtsignifikanz der Unterschiede zwischen N und J gering ist und die beobachteten Trends mit Vorsicht behandelt werden sollten. In einigen dieser Fälle stimmen die beobachteten Trends jedoch mit den Phänotypen der ersten Klasse von Parametern überein. Wir haben auch eine dritte, aber kleine Klasse von Parametern identifiziert, die hoch signifikante Unterschiede in zwei oder mehr Zentren aufwiesen (Abbildung 2; siehe Zusätzliche Datei 3, Abbildung S2d, h), aber unerwartet den entgegengesetzten Trend in einem der Zentren. Wir diskutieren die Gründe für diese Anomalien, die in einigen Fällen vermutlich auf Gen-Zentrum-Wechselwirkungen zurückzuführen sind. Die letzte Klasse stellt eine große Anzahl von Tests dar, bei denen wir keine konsistenten und signifikanten Unterschiede zwischen den Zentren festgestellt haben, was zu dem Schluss führt, dass es sich eher um falsch positive Ergebnisse als um Hinweise auf N / J-Unterschiede handelt (siehe Zusätzliche Datei 3, Abbildung S2c) , g).

Dysmorphologie und Ophthalmologie

Wir fanden keine Hinweise auf wesentliche Unterschiede in den morphologischen Merkmalen zwischen N und J, einschließlich der Röntgenanalyse des Skeletts. Es wurde jedoch eine Reihe von ophthalmologischen Unterschieden zwischen den beiden Stämmen festgestellt. Die Analyse der allgemeinen visuellen Funktionen unter Verwendung der virtuellen optokinetischen Trommel ergab eine verminderte Sicht in N im Vergleich zu J-Mäusen (N: 0,314 Zyklus / Grad, 95% CI 0,305 bis 0,323, n = 89; J: 0,399 Zyklen / Grad, 95% CI 0,394 bis 0,404, n = 128; p < 0,001, Student-t-Test). Dies spiegelte keine Unterschiede in der Linsentrübung wider, da eine quantitative Analyse unter Verwendung einer Scheimpflug-Kamera transparente Linsen in fand beide Stämme (N: 5,2 + 0,5%, n = 10; J: 5,0% + 0,5% Opazität, n = 10). Weiße Flecken wurden im Fundus von N Mäusen mit einer hohen Häufigkeit gesehen, die bei J Mäusen fehlten ( Dies ist wahrscheinlich auf das Vorhandensein der Crb1rd8-Mutation in N-Mäusen zurückzuführen, wie zuvor berichtet, obwohl in unserem Fall die Flecken nur in der ventralen Retina mit Variationen in der Fleckgröße und dem betroffenen Bereich zwischen Mäusen gesehen wurden (3A). Weitere Studien mit topischer Fundusendoskopie zeigten, dass die Anzahl der Hauptgefäße variabel war und zwischen drei und sieben für Venen und drei und eig lag ht für Arterien (3B) und eine gegebene Maus könnte nicht übereinstimmende Zahlen zwischen den beiden Augen haben. Die mittlere Anzahl sowohl von Venen als auch von Arterien war bei J signifikant höher (P < 0,001) als bei N Mäusen (3C).

Herz-Kreislauf

Nicht-invasive Blutdruckmessungen (ESLIM_002) zeigten, dass der systolische arterielle Druck bei J-Mäusen signifikant höher war als bei N-Mäusen, obwohl festgestellt wurde, dass die Signifikanz des Effekts zwischen den Geschlechtern und zwischen den Zentren unterschiedlich ist. Darüber hinaus beobachteten alle Zentren, dass die Pulsfrequenz bei N signifikant höher war als bei J-Mäusen.Ein sekundärer Partner innerhalb des Konsortiums stellte jedoch fest, dass die Herzfrequenz unter Narkose bei N-Mäusen signifikant niedriger war als bei männlichen J-Mäusen, was sich in einem langen Intervall zwischen Schlägen (RR) und QTc widerspiegelte. Wir fanden auch, dass das auf die Tibia-Länge normalisierte Herzgewicht (ESLIM_020) in zwei der Zentren bei N signifikant niedriger war als bei J-Mäusen, und diese Ergebnisse wurden unabhängig durch Sekundäranalyse bestätigt. Weitere Untersuchungen der Herzstruktur und -funktion durch Echokardiographie und der Herzkontraktionsfunktion durch Hämodynamik ergaben keine Unterschiede zwischen N und J (Daten nicht gezeigt).

Metabolismus

Für indirekte Kalorimetriemessungen Bei frei gefütterten Mäusen (ESLIM_003) fanden wir einen konsistenten Unterschied zwischen N und J hinsichtlich O2-Verbrauch, CO2-Produktion und Wärmeerzeugung. J-Mäuse zeigten im Vergleich zu N, das bei Frauen im Allgemeinen stärker ausgeprägt war, einen verringerten Gasaustausch und einen geringeren Energieverbrauch (Wärmeerzeugung oder Stoffwechselrate). Bei der sekundären Phänotypisierung mit nüchterner indirekter Kalorimetrie gab es einen Trend zu einem geringeren Energieverbrauch in J gegenüber N während der Nachtperiode. Dies war möglicherweise mit einer verminderten ambulanten Aktivität in J und einer geringeren Nahrungsaufnahme in J im Vergleich zu N während der Nacht verbunden, insbesondere bei erneuter Fütterung (Daten nicht gezeigt). In den beiden Zentren, in denen die Aktivität gemessen wurde, gab es im frei gefütterten Kalorimetriebildschirm (ESLIM_003) keinen konsistenten Aktivitätsunterschied (siehe Zusätzliche Datei 3, Abbildung S2c, g). Vereinfachte intraperitoneale Glukosetoleranztests (IPGTTs) (ESLIM_004) zeigten eine beeinträchtigte Glukosetoleranz bei J- gegenüber N-Mäusen. Diese Beobachtungen zum Glucosestoffwechsel stimmen mit der bekannten Deletion des für J-Mäuse spezifischen Nnt-Gens überein, von dem gezeigt wurde, dass es eine Rolle bei der Regulation der Insulinantwort in Pankreas-Beta-Zellen spielt.

Dual Energy X. -Rray-Absorptiometrie (DEXA) -Körperzusammensetzung und Knochendensitometriemessungen (ESLIM_005) zeigten, dass N-Mäuse eine erhöhte Fettmasse aufweisen (sowohl absolut als auch auf das Gewicht normalisiert). Darüber hinaus zeigten DEXA-Messungen, dass J-Mäuse im Vergleich zu N eine erhöhte Magermasse aufweisen. In zwei der Zentren waren die Messungen der Knochenmineraldichte bei J-männlichen Mäusen höher; Dieser Befund wurde jedoch nicht in dem dritten Zentrum wiederholt, in dem DEXA-Bildschirme durchgeführt wurden. Wir führten eine Mikrocomputertomographie (μCT) -Analyse der beiden Stämme durch (Abbildung 4) und stellten fest, dass die kortikale Dicke, die kortikale Porosität und das trabekuläre Knochenvolumen zwischen N und J unverändert waren. Zusätzlich wurden verschiedene Mikroarchitekturen analysiert Parameter zeigten an, dass das gesamte Trabekelnetzwerk ähnlich war. Schließlich konnten bei der Messung der Knochenbildungs- und Resorptionsmarker keine Unterschiede zwischen den beiden Stämmen festgestellt werden (Abbildung 4).

Neurologische, Verhaltens- und sensorische

Zwei Zentren zeigten große und konsistente Unterschiede zwischen N und J in der Aktivität im offenen Feld (ESLIM_007) (2), einschließlich einer höheren Aktivität in J-Mäusen, gemessen anhand der zurückgelegten Entfernung, und einer höheren Anzahl von Zentreneinträgen, was auf eine verringerte Angst hinweist. Diese Unterschiede stimmen mit Daten überein, die kürzlich über einen Verhaltensvergleich von N und J berichtet wurden. Interessanterweise beschränkten sich die wichtigsten Effekte auf Männer in beiden Zentren. Unerwarteterweise wurde in einem dritten Zentrum das Gegenteil beobachtet, wobei N-Mäuse aktiver als J waren, obwohl diese Effekte sowohl bei Männern als auch bei Frauen beobachtet wurden. Ein viertes Zentrum erkannte diese Effekte nicht und stellte keine signifikanten Unterschiede fest. Alle Zentren verwendeten die EMPReSSslim-SOP für das Verfahren, das die Anforderung von Arenen ähnlicher Größe beinhaltete. Es gab jedoch einige betriebliche Unterschiede zwischen den Zentren, einschließlich der Verwendung einzelner oder mehrerer Räume zur Unterbringung der Arenen. Arenen mit transparenten oder undurchsichtigen Seiten; und das Fehlen oder Vorhandensein einer Umweltanreicherung in Heimkäfigen (von der bekannt ist, dass sie sich auf die Verhaltensergebnisse auswirkt). Keine dieser Variablen stimmte jedoch mit den unterschiedlichen Beobachtungen zwischen den Zentren überein.Wir können jedoch Einflüsse des Darmmikrobioms nicht ausschließen, von denen zu erwarten ist, dass sie sich zwischen den Zentren unterscheiden. Es ist bekannt, dass das Darmmikrobiom die Funktion und das Verhalten des Zentralnervensystems hauptsächlich über die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse beeinflusst. Wir schließen daraus, dass unter bestimmten Bedingungen signifikante Unterschiede in den Freilandparametern zwischen N und J erkennbar sind, die Art dieser Unterschiede jedoch empfindlich gegenüber unbekannten Umgebungsbedingungen ist. Es ist interessant, dass der wichtigste widersprüchliche Befund bei den N- und J-Phänotypen auf eine Plattform zur Verhaltensphänotypisierung beschränkt war. Im Gegensatz dazu fanden wir bei den meisten anderen Tests (abgesehen von einigen hämatologischen und klinischen Chemieparametern, siehe unten) keine Inkonsistenzen, was darauf hinweist, dass Verhaltensanalysen im Gegensatz zu den meisten Phänotypisierungsplattformen akut empfindlich gegenüber Umweltparametern sein können. P. >

Wir haben auch einen Hell / Dunkel-Übergangstest durchgeführt, um die Angst bei N- und J-Stämmen zu vergleichen (Abbildung 5). Wir fanden keine signifikanten Unterschiede zwischen N- und J-Mäusen in der Anzahl der Hell-Dunkel-Übergänge oder in der prozentualen Zeit, die im dunklen Kompartiment verbracht wurde. Die Latenz zum Eintritt in das dunkle Kompartiment war jedoch bei N-Mäusen signifikant höher. Modifizierte SHIRPA-Tests (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phänotypbewertung) (ESLIM_008, Abbildung 1a) in allen vier Zentren zeigten, dass männliche J-Mäuse eine signifikant erhöhte Bewegungsaktivität aufwiesen, was mit den Ergebnissen einer erhöhten zurückgelegten Strecke korrelierte Freilandversuche in einigen Zentren (siehe oben).

Wir haben eine Reihe von Tests durchgeführt, die die Motorik widerspiegeln. Unterschiede in der Griffstärke (ESLIM_009) wurden in allen Zentren festgestellt, wobei J höher als N war, die betroffenen Parameter jedoch unterschiedlich waren. Einige Zentren berichteten über Unterschiede in der Griffstärke der Vorderbeine und einige in der Griffstärke der Vorder- und Hinterbeine zusammen (Abbildung 1a) , b). Rotarod-Tests (ESLIM_010) zeigten signifikante Unterschiede in der Latenz, um über alle Zentren hinweg zu fallen, obwohl die verringerte motorische Fähigkeit von N nur bei Frauen in zwei der Zentren beobachtet wurde. Wir untersuchten die motorischen Fähigkeiten bei männlichen N- und J-Mäusen weiter, indem wir die motorische Lernleistung auf dem Rotarod über 4 Tage untersuchten (Abbildung 5). Während sich die motorische Leistung von J-Mäusen von Tag 1 bis Tag 2 deutlich verbesserte, verbesserte sich die Leistung von N-Mäusen nur allmählich und unterschied sich signifikant von den Messungen von Tag 1 nur von Tag 3 (P < 0,05) ab. Darüber hinaus gab es von Tag 2 bis Tag 4 hoch signifikante Unterschiede in der Latenz zwischen N und J. Die in den Zentren durchgeführten Primärprüfungen ergaben somit eine potenziell verringerte Motorleistung in N, die durch komplexere Tests bestätigt und weiter ausgearbeitet wurde

Wir haben außerdem zwei zusätzliche Verhaltenstests durchgeführt, um die Unterschiede zwischen N und J weiter zu untersuchen. Zunächst verglichen wir die Leistung von N und J im Morris-Wasserlabyrinth-Test zur Bewertung des räumlichen Gedächtnisses. N männliche Mäuse zeigten im Vergleich zu J männlichen Mäusen eine sehr signifikant verringerte Leistung (höhere Latenz) (6). Zweitens untersuchten wir emotionales Lernen oder Gedächtnis für ein aversives Ereignis unter Verwendung der Cue- und kontextuellen Angstkonditionierungstests. Hier fanden wir jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Stämmen (Daten nicht gezeigt).

Die Untersuchung des akustischen Schreckens und der Hemmung vor dem Puls (ESLIM_011) (1a) in den beiden Stämmen identifizierte eine Vielzahl von Parametern das war signifikant und konsistent zwischen den Zentren unterschiedlich. Die akustische Schreckgröße bei 110 dB und die Schreckreaktionsgröße auf Vorimpuls und Impuls (PP1-PP4 + Impuls, siehe EMPReSSslim) waren in N im Vergleich zu J verringert, obwohl dieser Effekt bei Frauen in einem Zentrum nicht beobachtet wurde. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen fanden wir, dass die Hemmung vor dem Puls zwischen N und J unterschiedlich war, wobei die Hemmung vor dem Puls bei PP2 und PP3 und die globale Hemmung in N im Vergleich zu J zunahmen. Mehrere andere Parameter für die Größe des Schreckens und die Hemmung vor dem Puls zeigten signifikante Effekte in ein oder zwei Zentren (Abbildung 1b; siehe Zusatzdatei 3, Abbildung S2b, f), aber in anderen Zentren wurden keine Unterschiede festgestellt. Die Beobachtungen zur Größe des Schreckens wurden nicht durch Unterschiede im Gehör verwechselt, da wir die Hörschwellen sowohl bei J- als auch bei N-Mäusen unter Verwendung des auditorischen Hirnstamm-Reaktionstests bewerteten und keine Unterschiede fanden (Daten nicht gezeigt).

Klinische Chemie

An Plasmaproben, die am Ende jeder Phänotypisierungspipeline entnommen wurden, wurden umfangreiche Panels klinischer Chemietests durchgeführt. Die Blutprobe am Ende von Pipeline 1 (ESLIM_021) wurde nach einem Fasten über Nacht entnommen, während die Probe am Ende von Pipeline 2 (ESLIM_015) von einem frei gefütterten Tier stammte.Daten, die von mindestens drei Zentren übereinstimmten, zeigten, dass Harnstoff und die Elektrolyte Natrium, Kalium und Chlorid im Plasma von J-Mäusen im Vergleich zu N-Mäusen signifikant höher waren (1a), obwohl es einige klare Wechselwirkungen zwischen Geschlecht und Zentrum gab. Daten für frei gefütterte und nüchterne Plasmaglucosespiegel zeigten, dass für jeden Test mindestens zwei Zentren feststellten, dass die Plasmaglucosespiegel bei N-Mäusen höher waren als bei J-Mäusen (1b). Es ist jedoch bekannt, dass der Blutzuckerspiegel durch den Umgang mit Tieren, die Probenverarbeitung und die Verwendung von Anästhetika beeinflusst wird. Die hier dargestellten Daten stammen alle aus Proben, die unter gasförmigem Isofluorananästhetikum entnommen wurden, mit Ausnahme eines Zentrums, in dem Proben unter Ketamin / Xylazin-Injektion entnommen wurden (siehe Abbildung 1). Wie oben diskutiert, scheint es aufgrund ihrer bekannten Beeinträchtigung der Insulinsekretion widersprüchlich zu sein, dass J-Mäuse niedrigere Plasmaglucosespiegel als N-Mäuse aufweisen, aber die Deletion in Nnt scheint nur die Glucose-Clearance-Raten zu beeinflussen und J-Mäuse zu fasten oder nicht herauszufordern keine konstante Hyperglykämie haben. Es wurde gezeigt, dass mehrere andere Parameter bei J in mindestens zwei Zentren höher sind als bei N-Mäusen, aber in jedem Fall berichteten die anderen Zentren keine signifikanten Unterschiede bei denselben Parametern (1b), beispielsweise bei freien Fettsäuren. Zwei Zentren fanden heraus, dass Eisen bei N-Männern signifikant höher war und dass alkalische Phosphatase bei J-Männern signifikant höher war. Eines dieser Zentren stellte fest, dass dies auch bei Frauen der Fall ist (Abbildung 2). Daten für jeden dieser Parameter aus einem dritten Zentrum widersprechen diesen Befunden.

Hämatologie

Am Ende von Pipeline 2 (ESLIM_016) wurden verschiedene hämatologische Parameter gemessen. Signifikante Änderungen in einer Reihe von Parametern wurden von zwei Zentren gefunden, aber diese Ergebnisse wurden in den anderen nicht repliziert, einschließlich der Anzahl der weißen und roten Blutkörperchen, des mittleren Zellvolumens und des mittleren korpuskulären Hämoglobins (Abbildung 1b). Widersprüchliche Ergebnisse wurden für Hämatokrit- und mittlere Zellhämoglobinkonzentrationstests erhalten (2). In jedem Fall stimmten Daten von zwei Zentren überein, während ein drittes Zentrum den gegenteiligen Effekt zeigte. Dies könnte möglicherweise auf die unterschiedlichen Maschinentechnologien zurückzuführen sein, die für hämatologische Messungen in den teilnehmenden Kliniken verwendet werden, wie in den Metadaten aufgezeichnet.

Immunfunktion und Allergie

Wir untersuchten eine Reihe von sekundären Phänotypen einschließlich Wirtsresistenz gegen Listeria monocytogenes in den J- und N-Stämmen. Frauen beider Stämme waren anfälliger für eine Infektion mit L. monocytogenes; Der geschlechtsspezifische Unterschied in der Empfindlichkeit des Listeria-Wirts war jedoch bei N weniger ausgeprägt als bei J. Männer des N-Stammes zeigten am Tag 4 nach der Infektion im Vergleich zu J-Männern eine verbesserte Clearance von Listeria. Dies korreliert mit einer erhöhten proinflammatorischen Reaktion bei N Männern am Tag 3 nach der Infektion im Vergleich zu J Männern (7).

Wir haben auch N- und J-Mäuse auf getestet Dinitrofluorbenzol (DNFB) -induzierte Kontaktüberempfindlichkeit (CHS). Es wurden signifikante Unterschiede in der CHS-Antwort zwischen den beiden Mäusestämmen identifiziert, wobei J eine erhöhte CHS-Antwort zeigte. Bemerkenswerterweise zeigten weibliche Mäuse beider Stämme im Vergleich zu männlichen Mäusen ein erhöhtes CHS. Die Untersuchung der Reaktion von natürlichen Killerzellen (NK) auf verschiedene Stimuli zeigte, dass ein größerer Anteil der NK-Zellen durch Interleukin (IL) -12 allein oder in Kombination mit IL-2 in J im Vergleich zu N-Mäusen aktiviert wird; Auch diese Reaktion war bei Frauen signifikanter (Abbildung 8).