Antibiootteja on käytetty vuosituhansien ajan infektioiden hoidossa, vaikkakaan viime vuosisadalle saakka ihmiset eivät tienneet, että infektiot olivat bakteerien aiheuttama. Eräiden muottien ja kasviuutteiden avulla hoidettiin joidenkin varhaisimpien sivilisaatioiden infektioita – esimerkiksi muinaiset egyptiläiset levittivät homeista leipää tartunnan saaneisiin haavoihin. Siitä asti saakka 1900-luvulle saakka bakteerien aiheuttamat infektiot, joita nyt pidämme yksinkertaisina, kuten keuhkokuume ja ripuli, olivat ihmiskuoleman ykkössyy kehittyneissä maissa.
Sitä ei ollut 1800-luvun loppupuolelle asti tutkijat alkoivat tarkkailla antibakteerisia kemikaaleja toiminnassa. Saksalainen lääkäri Paul Ehrlich totesi, että tietyt kemialliset väriaineet värittivät joitain bakteerisoluja, mutta eivät muita. Hän totesi, että tämän periaatteen mukaan on oltava mahdollista luoda aineita, jotka voivat tappaa tiettyjä bakteereja valikoivasti vahingoittamatta muita soluja. Vuonna 1909 hän huomasi, että arsfenamiiniksi kutsuttu kemikaali oli tehokas hoito kuppa. Tästä tuli ensimmäinen moderni antibiootti, vaikka Ehrlich itse viittasi löytöönsä ”kemoterapiana” – kemikaalin käyttöön sairauden hoidossa. Sanaa ”antibiootit” käytti ensimmäisen kerran yli 30 vuotta myöhemmin ukrainalaisamerikkalainen keksijä ja mikrobiologi Selman Waksman, joka löysi elinaikanaan yli 20 antibioottia.
Alexander Fleming näytti siltä, hänen työnsä ja löysi vahingossa penisilliinin. Palattuaan lomalta Suffolkista vuonna 1928 hän huomasi, että sieni, Penicillium notatum, oli saastuttanut vahingossa paljastamattomien Staphylococcus-bakteerien viljelylevyn. Sieni oli luonut bakteereista vapaat alueet kaikkialle, missä se kasvoi levyllä. Fleming eristää ja kasvatti hometta puhtaassa kulttuurissa. Hän havaitsi, että P. notatum osoittautui erittäin tehokkaaksi jopa hyvin pienillä pitoisuuksilla, estäen Staphylococcus-kasvua jopa 800 kertaa laimennettuna, ja oli vähemmän myrkyllinen kuin tuolloin käytetyt desinfiointiaineet.
Varhaisten kokeiden jälkeen ihmisen haavojen hoidossa , yhteistyö brittiläisten lääkeyritysten kanssa varmisti, että penisilliinin (P. notatumin tuottama antibioottikemikaali) massatuotanto oli mahdollista. Yhdysvaltojen osavaltiossa Massachusettsissa Bostonissa tapahtuneen tulipalon jälkeen, jossa kuoli lähes 500 ihmistä, monet eloonjääneistä saivat ihosiirroksia, jotka ovat alttiita Staphylococcus-infektiolle. Hoito penisilliinillä oli erittäin onnistunutta, ja Yhdysvaltain hallitus alkoi tukea lääkkeen massatuotantoa. D-Dayyn mennessä vuonna 1944 penisilliiniä käytettiin laajalti joukkojen hoitoon infektioiden varalta sekä kentällä että sairaaloissa kaikkialla Euroopassa. Toisen maailmansodan loppuun mennessä penisilliinille annettiin lempinimi ”ihmelääke” ja se oli pelastanut monia ihmishenkiä.
Oxfordin tiedemiehet olivat avainasemassa massatuotantoprosessin kehittämisessä, ja Howard Florey ja Ernst Chain jakoivat vuoden 1945 Nobelin lääketieteellinen palkinto Alexander Flemingin kanssa heidän roolistaan ensimmäisen massatuotetun antibiootin luomisessa.