Kun toinen persialaisten hyökkäys Kreikkaan alkoi vuonna 481 eKr., Leonidas valittiin johtamaan kreikkalaisia yhdistettyjä joukkoja, koska molemmat johtuivat spartalaisten maineesta ylivoimaisena armeijana valtakunnassa, ja oman kykynsä takia kenraalina. Sanotaan, että kuningas vieraili Delfissä sijaitsevassa Oracle-hotellissa, jota kuultiin tärkeistä valtion asioista koko muinaisessa Kreikassa, ja Oracle esitti suuren jakeen, joka kertoi hänelle, että hänen on annettava henkensä estääkseen valtakuntansa tuhoutumista. Persia.
Elokuussa 480 eKr. Leonidas marssi tapaamaan Persian kuningas Xerxesin armeijan Thermopylaessa, kapealla rannikkokäytävällä, joka makasi persialaisten reitillä sisämaassa. Hänellä oli mukanaan vain 300 spartalaista eliittisotilasta ja 900 orjaa, minkä hän lisäsi marssiessaan maastojuoksussa muiden kaupunkivaltioiden läpi, jolloin päätyi yhteensä 4000-7000 miehen armeijaan. Erilaisia selityksiä siitä, miksi voima oli niin pieni, on esitetty. Herodotus esitti, että spartalaiset marssivat suoraan ulos, joten heidän ei nähty osoittavan pelkoa, odottaen, että suurempi armeija kokoontuisi ja seuraisi pian sen jälkeen, mutta nykyajan historioitsijat uskovat sisäisiä riitoja tai jopa sitä, että olympialaisia pidettiin tuolloin olisi voinut olla syyllinen.
Persian armeija, jonka he kohtaivat, oli valtava määrä. Herodotoksen arvio kahdesta miljoonasta miehestä on sittemmin purettu, mutta luku oli vähintään 70 000 ja mahdollisesti jopa 300 000. Neljän päivän umpikuja seurasi, sitten persialaiset hyökkäsivät viidentenä päivänä. Kahden päivän ajan kreikkalaiset pidättivät persialaisia ja tappoivat noin 10 000 heidän miestä, mukaan lukien kaksi kuningas Xerxesin veljeä. Seitsemäntenä päivänä petturi nimeltä Ephialtes otti yhteyttä Persian kenraaliin Hydarnesiin ja näytti hänelle piilotettua polkua, jolla hän voisi kulkea päästäkseen kreikkalaisten taakse. Tietäen, että hänet on nyt syrjäytetty, Leonidas lähetti kaikki kreikkalaiset joukot ja päätti pysyä passissa 300 spartalaisensa ja orjansa, 400 tebanilaisen ja 700 thespialaisen kanssa.
Herodotus kirjoitti, että Leonidas lähetti miehet pois varmistamaan, että he elävät taistelemaan toisen päivän ja ovat hyödyllisiä tulevassa taistelussa persialaisia vastaan, ja spartalaiset pysyivät sekä suojelemassa kreikkalaisten pakenemista että koska he eivät koskaan voineet luopua asemastaan taistelukentällä. Thespialaisten oletettiin lähetetyn pois muiden kreikkalaisten kanssa, mutta he jäivät omasta tahdostaan.
Xerxes tarjoutui tarjoamaan säästää spartalaisten elämää, jos he luopuisivat aseistaan, mihin Leonidas vastasi ” ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(tule ja ota heidät.) Miehet taistelivat katkera viimeinen kanta persialaisia vastaan, ja kaikki tapettiin lukuun ottamatta 400 tebaania, jotka antautuivat persialaisille ilman taistelua. Leonidaksen tapettuaan spartalaiset taistelivat hakemaan takaisin. Leonidas oli kuolemansa aikaan noin 60-vuotias, ja hänen seuraajakseen tuli hänen poikansa Pleistarchus.