P53-reitti: positiiviset ja negatiiviset palautesilmukat

Erilaisissa kirjallisuustutkimuksissa on tunnistettu 10 positiivista tai negatiivista palautesilmukkaa p53-reitillä (katso kuvat 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ja 10). Kukin näistä silmukoista luo piirin, joka koostuu proteiineista, joiden aktiivisuuteen tai synteesinopeuksiin p53: n aktivaatio vaikuttaa, ja tämä puolestaan johtaa p53-aktiivisuuden muutokseen solussa. Näistä seitsemän on negatiivisia takaisinkytkentäsilmukoita, jotka moduloivat p53-aktiivisuutta (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, sykliini G, Wip-1 ja Siah-1) ja kolme ovat positiivisia takaisinkytkentäsilmukoita (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF ja Rb), jotka moduloivat p53-aktiivisuutta. Kaikki nämä verkot tai piirit ovat autoregulatiivisia siinä mielessä, että ne joko indusoituvat p53-aktiivisuuden avulla transkriptiotasolla, ne repressoidaan p53: lla (p14 / 19 ARF, kuvio 3) tai niitä säätelevät p53: n indusoimat proteiinit. Kuusi näistä palautesilmukoista toimii MDM-2: n kautta (MDM-2, sykliini G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT ja Rb) moduloidakseen p53-aktiivisuutta. >

Jännittävä havainto on, että p53-reitti on läheisessä yhteydessä muihin signaalinsiirtoihin polkuja, joilla on merkittävä rooli syövän alkuperässä. Yksi ensimmäisistä tutkituista yhteyksistä sisältää p14 / p19ARF: n ja MDM-2: n. P14 / 19 ARF -proteiini sitoutuu MDM-2-proteiiniin ja moduloi sen ubikitiiniligaasiaktiivisuutta alaspäin, mikä lisää p53-proteiinin tasoja (Honda ja Yasuda, 1999) (kuvio 3). P14 / 19 ARF -geenin transkriptiota säätelevät positiivisesti E2F-1 (Zhu et ai., 1999) ja beetakateniini (Damalas et ai., 2001) ja negatiivisesti säätelee itse p53. Lisäksi p14 / 19 ARF -proteiinin tasot kasvavat Ras- ja Myc-aktiivisuuksien avulla solussa (kuvio 3). P53: n p14 / p19 ARF: n säätelyn monimutkaisuutta on hiljattain tarkasteltu (Lowe ja Sherr, 2003). P14 / 19 ARF-MDM-2 -kompleksit lokalisoituvat usein solun ytimessä johtuen p14 / p19 ARF: ssä olevista nukleolaarisista lokalisointisignaaleista. Ydin on ribosomaalisen biogeneesin kohta ja p14 / 19 ARF -aktiivisuus itse voi muuttaa ribosomaalisen RNA-esiasteen RNA-prosessoinnin nopeutta kypsiksi ribosomaalisiksi alayksiköiksi (Sugimoto et ai., 2003). Siten p14 / 19 ARF: llä säätelemällä MDM-2- ja p53-tasoja ja koordinoimalla tämä ribosomaalisen biogeneesin kanssa on tärkeä rooli solusyklin säätelyssä. Tätä on äskettäin vahvistettu osoittamalla, että p14 / 19 ARF -proteiini voi säätää myös Myc-aktiivisuutta (ja siten solukokoa) (Datta et ai., 2004). MDM-2 ytimessä ei kuitenkaan ole passiivinen kokonaisuus. MDM-2-proteiinin on osoitettu sitoutuvan spesifisesti kolmeen suureen ribosomaaliseen alayksikköproteiiniin L5, L11 ja L23 (Marechal et ai., 1994; Lohrum et ai., 2003; Zhang et ai., 2003; Dai et ai., 2004 ), ja L5: n (Dai ja Lu, 2004) tai L11: n (Lohrum et ai., 2003; Zhang et ai., 2003) sitoutuminen MDM-2: een alentaa sen ubikvitiiniligaasiaktiivisuutta. Lisäksi MDM-2: n renkaan sormidomeeni sitoutuu spesifisesti RNA-sekvenssiin, joka löytyy suuresta ribosomaalisesta RNA-alayksiköstä (Elenbaas et ai., 1996). Vaikka kaikki nämä havainnot viittaavat MDM-2: n ja p14 / 19 ARF: n keskeiseen rooliin ribosomien biogeneesin ja solusyklin säätelyssä, emme ymmärrä, miten nämä havainnot muodostavat tämän säätelysilmukan.

Rb-proteiini löytyy soluista kompleksissa MDM-2: n ja p53: n kanssa, mikä johtaa korkeaan p53-aktiivisuuteen ja lisääntyneeseen apoptoottiseen aktiivisuuteen (Xiao et ai., 1995). Aktiivisen E2F-1: n korkea taso, joka ei ole sitoutunut Rb: hen, vaihtaa p53-vasteen G-1-pysäytyksestä apoptoosiin. Sekä Rb että MDM-2 fosforyloivat ja estävät sykliini E-cdk2: lla (kuvio 4). Kun p53 on aktivoitu, se stimuloi p21-proteiinin synteesiä, joka estää sykliini E-cdk2 -aktiivisuuden, ja tämä puolestaan vaikuttaa Rb-MDM-2-kompleksiin, joka edistää p53-aktiivisuutta ja apoptoosia. DNA-vaurioiden jälkeen sekä MDM-2-proteiini että p53-proteiini modifioidaan ATM-proteiinikinaasilla (kuvio 4). Tämä lisää p53-aktiivisuutta samalla tavalla kuin p53-MDM-2-Rb-kompleksi lisää p53: n toimintaa ja on proapoptoottista. Yksityiskohtaisesta viimeaikaisesta katsauksesta p53-Rb-E2F1-akselille katso Yamasaki (2003).

Osa p53-proteiinin aktivaatiosta sisältää p53-proteiinin fosforylaation seriineissä, jotka sijaitsevat tähteissä 33 ja 46. p38 MAP-kinaasi (kuva 5). Tämä p38 MAP-kinaasi aktivoituu itse fosforylaatiolla (jota säätelee Ras-Raf-Mek-Erk-reitti), jonka Wip-1-fosfataasi voi kääntää tai inaktivoida. Wip-1 on p53-reagoiva tai p53-säätelty geeni, joka muodostaa negatiivisen autoregulointisilmukan ja yhdistää p53- ja Ras-reitit (Takekawa et ai., 2000) (kuva 5). Aktivoitu p53-proteiini säätelee positiivisesti ubikitiiniligaasin Siah-1 transkriptiota (Fiucci et ai., 2004), joka puolestaan vaikuttaa hajottamaan beeta-kateniiniproteiinia (Iwai et ai., 2004) (kuvio 6). Beetakateeniinitasot voivat säätää p14 / 19 ARF -geeniä, mikä puolestaan säätelee negatiivisesti MDM-2: ta ja johtaa korkeampiin p53-tasoihin (positiivinen palautesilmukka) (kuvio 6). Siah-1 yhdistää siten Wnt-beeta-kateniini-APC-reitin p53-reittiin. Joissakin solutyypeissä p53-proteiini indusoi PTEN-geenin transkription (kuvio 7). PTEN-proteiini on PIP-3-fosfataasi. PIP-3 aktivoi AKT-kinaasin, jolla on useita antiapoptoottisia proteiinisubstraatteja, mukaan lukien MDM-2-proteiini. Fosforylaatio johtaa MDM-2: n translokaatioon ytimeen, jossa se inaktivoi p53: n (kuvio 7). Tämä yhdistää p53-reitin IGF-1-AKT-reittiin ja muodostaa positiivisen palautesilmukan parannetulle p53-aktiivisuudelle ja vähentyneelle AKT-aktiivisuudelle. Tätä silmukkaa p53-sääntelyssä on myös hiljattain tarkasteltu (Gottlieb et ai., 2002). Nämä positiiviset ja negatiiviset takaisinkytkentäsilmukat toteuttavat kaksi asiaa: (1) ne moduloivat p53-aktiivisuutta solussa ja (2) koordinoivat p53-aktiivisuutta muiden signaalinsiirtoreittien kanssa, jotka säätelevät solun pääsyä solusykliin (Rb-E2F-1, myc, Ras, beeta-kateniini, IGF-1 ja sykliini E-cdk2 -aktiivisuudet).

On olemassa kaksi muuta p53-autoregulaatiopiiriä, jotka palauttavat negatiivisesti p53: n toiminnan. Yksi aktiivisimmista p53-reagoivista geeneistä on sykliini G -geeni. Se transkriptoidaan nopeasti korkeille tasoille p53-aktivaation jälkeen monenlaisissa solutyypeissä (Okamoto ja Beach, 1994; Zauberman et ai., 1995; Bates et ai., 1996; Yardley et ai., 1998). Sykliini G -proteiini muodostaa kompleksin PP2A-fosfataasin kanssa, joka poistaa fosfaattitähteen MDM-2: sta (Okamoto et ai., 2002) (kuva 8), joka lisätään MDM-2-proteiiniin cdk-kinaasin (Zhang ja Prives, 2001) (kuva 4). MDM-2: n fosforylaatio sykliini A / cdk2: lla estää sen aktiivisuutta, joten sykliini G-PP2A -fosfataasi lisää MDM-2-aktiivisuutta ja estää p53: ta. Hiiret, joiden sykliini G -geeni on poistettu, ovat elinkelpoisia (Kimura et ai., 2001), ja sykliini G: n nolla hiiren alkion fibroblasteilla on kohonnut p53-proteiinitasot ilman stressiä (Okamoto et al., 2002), mikä osoittaa, että tämä palautesilmukka on toiminnassa in vivo ja vaikuttaa solun p53: n perustasoihin paitsi korkeammilla p53: n aktivoiduilla tasoilla stressin jälkeen. Toinen negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka sisältää p53-transkriptiotekijöiden perheen jäsenen, joka sisältää p53, p63 ja p73, jotka liittyvät rakenteeltaan ja toiminnallaan ja ovat kehittyneet yhteisestä esiasteesta. Stressivasteen jälkeen p53-geeni aktivoituu, mikä puolestaan stimuloi tietyn silmukoituneen m-RNA: n transkriptiota p73-geenistä, nimeltään p73 delta N (kuvio 9). Tämä kääntää p73-proteiinin ilman aminoterminaalista domeenia. Kaikilla kolmella p53-proteiiniperheellä on samanlaiset domeenirakenteet, jotka koostuvat N-terminaalisen transkription aktivaatiodomeenista, joka on kytketty ydindomeeniin, joka sitoutuu tiettyyn yllä käsiteltyyn DNA-sekvenssiin. Kaikki kolme p53-perheen transkriptiotekijää tunnistavat saman DNA-sekvenssin, vaikka p53, p63 ja p73 pystyvät aloittamaan erilliset transkriptio-ohjelmat. On kuitenkin olemassa suuri määrä yhteisiä geenejä, joita kaikki kolme proteiinia voivat säätää, kuten äskettäin tarkasteltiin julkaisussa Harms et ai. (2004).Siten, kun p53 aktivoi p73 delta N: n transkription, p73 delta N -proteiini voi sitoutua moniin p53: n säätelemiin geeneihin, mutta transaktivaatiodomeenin puuttuminen saa sen toimimaan p53: n transkription aktivaation repressorina tai kilpailijana. Tällä tavalla muodostetaan negatiivinen palautesilmukka ja p53-aktiivisuus vähenee (Grob et ai., 2001; Kartasheva et ai., 2002) (kuvio 9). Siten viisi näistä positiivisista tai negatiivisista takaisinkytkentäpiireistä (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) sisältää geenejä ja proteiineja, jotka ovat muiden signaalitransduktioreittien keskeisiä jäseniä, kun taas kaksi (sykliini G ja p73 delta) N) muodostavat suorat negatiiviset takaisinkytkentäsilmukat.

Lopulliset keskusteltavat negatiiviset takaisinkytkentäsilmukat ovat ubikitiiniligaasien muodossa. Yllättäen näyttää olevan kolme erilaista p53-ubiqutiiniligaasiaktiivisuutta (MDM-2, Cop-1 ja Pirh-1), joista kukin muodostaa autoregulointisilmukan, joka johtaa alempaan p53-aktiivisuuteen (Leng et ai., 2003; Dornan et ai. ., 2004) (kuva 10). Jokainen geeni aktivoituu transkriptionaalisesti p53: lla. Ainoa miksi tällainen irtisanomisaste on tällä hetkellä epäselvää. Useat mahdollisuudet ovat, että nämä geenituotteet ilmentyvät tai toimivat optimaalisesti erilaisissa solu- tai kudostyypeissä tai jopa eri kehitysvaiheissa. Esimerkiksi MDM-2-poistohiiri on tappava noin 6 vuorokauden kuluttua hedelmöityksestä juuri blastokystan istutuksen yhteydessä. Tämän voi laukaista hypoksia, jonka täytyy tapahtua tuossa vaiheessa, aktivoimalla p53 MDM-2: n poissa ollessa ja aiheuttaen apoptoosia. Tämän tulkinnan mukainen on havainto, että p53, MDM-2-kaksoispoistohiiri on elinkelpoinen ja syntyy yhtä normaalisti kuin p53-poistohiiri (Jones et ai., 1995; Montes de Oca Luna et ai., 1995). Tämä on siis sopusoinnussa ajatuksen kanssa, että MDM-2-proteiini toimii ilman ubikitiiniligaasin varatoimintaa blastokystavaiheessa, mutta nämä muut proteiinit saattavat sallia normaalin toiminnan myöhemmissä kehitysvaiheissa. Nämä ideat ovat nyt testattavissa. On myös mahdollista, että yksi tai useampi näistä kolmesta ubikvitiiniligaasista on mukana p53-tasojen ylläpitämisessä stressaamattomassa tai perustilassa, kun taas toiset vaikuttavat vasta stressin aiheuttaman p53: n tuottamisen jälkeen. Aktivoidulla p53: lla ja stressin indusoimilla p53-proteiineilla on hyvin erilaiset proteiinimodifikaatiot, ja tämän vaikutus MDM-2: n, Cop-1: n tai Pirh-2: n aktiivisuuteen on tällä hetkellä epäselvä. Vaikuttaa todennäköiseltä, että jokainen näistä kolmesta ubikitiiniligaasista muodostaa proteiinikomplekseja solussa ja niihin liittyvät proteiinit voivat hyvin erota kullekin näistä ligaaseista, yhdistämällä ne erilaisiin säätelypiireihin. Tällä hetkellä MDM-2: sta tiedetään paljon, ja Cop-1: n ja Pirh-2: n rooliin on kiinnitetty suhteellisen vähän huomiota, joista kirjallisuudessa on raportoitu vain viimeisen vuoden aikana. Lisäksi äskettäin p53: n osoitettiin olevan vielä toisen E3-ubikitiiniligaasientsyymin, toporien, substraatti (Rajendra et ai., 2004). Vielä on määritettävä, ovatko toporit myös p53: n transkriptiokohde, ja siksi ne olisi lisättävä kasvavaan proteiiniluetteloon, joka myötävaikuttaa p53-reitin autoregulaatiokontrolliin. Seuraavien vuosien tutkimuksessa pitäisi käsitellä näitä kysymyksiä.

Kuten edellä mainittiin, monet sääntelypiirit sisältävät MDM-2: n, mikä korostaa MDM-2: n keskeistä roolia p53-aktiivisuuden hallinnassa. P53- ja MDM-2-mutaatioiden geneettinen analyysi, joka estää tämän proteiinikompleksin, on tunnistanut jokaisessa proteiinissa kriittiset aminohappotähteet, jotka ovat tärkeitä tämän sitoutumisvuorovaikutuksen kannalta (Lin et ai., 1994; Freedman et ai., 1997). Näiden samojen aminohappotähteiden on osoitettu tekevän nämä proteiinikontaktit HDM-2: n (ihmisproteiini) aminopään ja p53: n aminopäästä peräisin olevan peptidin kiderakenteessa (Kussie et ai., 1996) . P53: n jäämät fenenyaliini 19, tryptofaani 23 ja leusiini 26 muodostavat pääkontaktit hydrofobisessa MDM-2-taskussa. Jäännösten seriini 20 ja mahdollisesti seriini 15 fosforylaation pitäisi heikentää näitä kontakteja, ja näiden kontaktien kanssa kilpailevat peptidit ja lääkkeet estävät p53 MDM-2 -kompleksin ja edistävät apoptoosia soluissa (Klein ja Vassilev, 2004). Siten p53-MDM-2-kompleksista ja MDM-2-ubikitiiniligaasiaktiivisuudesta on tullut tärkein lääkekohde joillekin syöpille. Noin kolmanneksessa ihmisen sarkoomista ja joissakin leukemioissa ja glioblastoomissa HDM-2-geeni on monistettu ja tämä proteiini yliekspressoituu. P53-geeni on villityyppi ja p53-proteiini on ilmeisesti inaktiivinen, joten lääkkeiden, jotka hajottavat p53-HDM-2-kompleksin, tulisi aktivoida p53. Lisäksi monet muut syövät näyttävät ilmentävän HDM-2-geenituotetta korkeilla tasoilla, vaikka HDM-2-geeniä ei monistettaisikaan. Tämän tyyppisissä syöpissä HDM-2-aktiivisuuden estäminen tai p53: n vapauttaminen tästä kompleksista voisi hyvin indusoida apoptoosin selektiivisesti syöpäsoluissa. Tämä voi myös parantaa joidenkin p53: n aktivoivien lääkkeiden kemoterapeuttista aktiivisuutta.

P53-MDM-2-autoregulointisilmukan ennustetaan asettavan oskillaattorin, jossa p53- ja MDM-2-tasot kasvavat ja vähenevät ajan myötä ja vaiheen ulkopuolella solussa. Tämä on osoitettu ensin mittaamalla MDM-2- ja p53-tasot käyttämällä p53-stressivasteen saaneiden viljelmien soluista peräisin olevia proteiineja Western blot -menetelmiä (Lev Bar-Or et ai., 2000). Vaikka värähtelyjä havaitaan ja vaimennetaan ajan myötä, tässä kokeessa keskimääräiset proteiinikonsentraatiot monista viljelmän soluista, jotka voivat olla vaiheen ulkopuolella värähtelyissään, aiheuttaen rakentavia tai tuhoavia häiriöitä. Tästä syystä fluoresoivasti merkittyjä p53- ja HDM2-fuusioproteiineja kuvattiin yksittäisissä soluissa p53- ja HDM-2-tasojen muutosten seuraamiseksi p53-stressivasteessa olevissa soluissa. Odotetut värähtelyt vaiheen ulkopuolella havaittiin ja yllättäen värähtelyjen määrä solussa oli verrannollinen näille soluille annettuun säteilyannokseen (Lahav et ai., 2004). Tämä viittaa siihen, että p53 voi mitata jännitesignaalin voimakkuutta digitaalisella tavalla (värähtelyjen määrä) eikä analogisella tavalla (korkeammat p53-pitoisuudet). Samanlaisia värähtelyjä on havaittu muilla signaalinsiirtoreiteillä, joilla on negatiiviset autoregulointisilmukat, kuten NF-κ-B-reitti NF-κ-B- ja I-κ-B-proteiinien kanssa (Scott et ai., 1993). Nämä digitaaliset signaalit, jotka johtuvat transkriptiotekijöiden määrän heilahteluista, voisivat hyvin johtaa jaksollisen geeniekspression malliin. Kuitenkin kuinka transkriptiotekijän tasolla olevat digitaaliset signaalit muunnetaan analogisiksi signaaleiksi geenin tuottaman mRNA: n määrän tasolla, on edelleen epäselvää. Nämä kokeet johtavat mahdollisuuteen, että erilaiset värähtelymäärät, värähtelyjen ajoitus tai aallonpituus tai näiden värähtelyjen amplitudi voivat vaikuttaa valitun geeniekspressiomallin ja p53: n tulokseen (solusyklin pysähtyminen, apoptoosi tai vanheneminen) vastaus.

Miksi p53-reitillä on niin paljon palautesilmukoita? Tähän kysymykseen on monia vastauksia. Kaikki mekanismit eivät välttämättä ole aktiivisia samassa solu- tai kudostyypissä tai samoissa kehitysvaiheissa. Tässä kuvatun tyyppiset takaisinkytkentäsilmukat tarjoavat keinon yhdistää p53-reitti muiden signaalitransduktioreittien kanssa ja koordinoida solusignaalit kasvua ja jakautumista varten. Järjestelmän redundanssit voivat joskus estää virheet ja varajärjestelmä vähentää mutaatioiden fenotyyppiä. Toisaalta kaikki kuvissa 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ja 10 esitetyt takaisinkytkentäsilmukat eivät voi kestää aikaa ja jatkokokeita. Monet näistä reiteistä on selvitetty kokeilla, jotka on tehty viljelyssä olevilla syöpäsoluilla, joiden mutaatiot muuttavat näitä reittejä. Jopa normaalit solut viljelmässä tai poistohiiret (mutaatioon sopeutumisen vuoksi) eivät välttämättä heijasta kaikkia olosuhteita, joita esiintyy normaaleissa soluissa ja elimissä in vivo. On erityisen vaikeaa todistaa, että spesifinen proteiinikinaasi tai fosfataasi vaikuttaa spesifiseen substraattiin in vivo ja että sillä on tulos, joka voidaan mitata kvantitatiivisesti. Siksi meidän on jatkettava niiden toimintojen ja reittien testaamista ja haastamista, joiden uskomme toimivan solussa. Nämä kuvioissa 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ja 10 esitetyt rakenteet ovat kuitenkin hyödyllisiä sellaisten hypoteesien ja ideoiden testauksessa, jotka varmasti johtavat uuteen oivallukseen syöpien luonteeseen ja lääkkeiden ja aineet, jotka tappavat selektiivisesti syöpäsolut.