Vertaileva fenotyyppinen ja genominen analyysi C57BL / 6J- ja C57BL / 6N-hiirikannoista

C57BL / 6N- ja C57BL / 6J-hiirten genomisekvenssivertailut SNP: lle ja pienille indelleille

Käytimme C57BL / 6N: n pariliitosta kohdistamista vertailugeeniin (C57BL / 6J) 17 hiiren genomiprojektista. Luettelo erilaisten varianttien (SNP: t, pienet indelit ja SV: t) kahden genomin välillä luotiin kuitenkin uudella sisäänrakennetulla menettelyllä tarkkojen oletettujen sekvenssimuutosten tunnistamisen todennäköisyyden lisäämiseksi. Keskeinen analyysivaihe laadukkaan varianttisarjan tunnistamiseksi kohdistuksesta oli hyödyntää Broad Instituten luomaa vasta luodtua C57BL / 6J: n lyhytlukuista genomisekvenssiä. Tämän avulla voimme tunnistaa kokoonpanovirheet viitesekvenssissä. Lisäksi päivitimme varianttien havaitsemismenetelmän: ensin käyttämällä erilaisia ja / tai kehittyneempiä ohjelmistoja varianttien havaitsemiseen; toiseksi suorittamalla manuaalinen kuratointi kaikille koodausvaihtoehdoille ja kolmanneksi vahvistamalla laajasti suuri osa muunnelmista (mukaan lukien kaikki koodausvaihtoehdot) sekvenssiennusteiden vahvistamiseksi. Nämä vaiheet antoivat vankan tietojoukon korkealaatuisista koodausvaihtoehdoista, mikä vähentää huomattavasti vääräpositiivista määrää.

Tunnistaaksemme SNP: t ja pienet indeksit, jotka erottavat C57BL / 6J- ja C57BL / 6N-kannat, käytimme pariliitosta 17 hiiren genomiprojektin tuottamat loppulukemat. Kutsuimme variantteja käyttämällä Genomianalyysityökaluja (GATK) ja löysimme 681220 muunnosta, jotka erottavat C57BL / 6J- ja C57BL / 6N-kannat. Käyttämällä Broad Instituten tuottamaa lyhytluettua C57BL / 6J-genomisekvenssiä pystyimme suodattamaan mahdolliset sekvensointivirheet poistamalla Broad C57BL / 6J -sekvenssille yhteiset variantit, mikä tasoitti referenssissa esiintyviä ristiriitaisuuksia ja samalla parantaa vääriä negatiivisia korko. Loput lukemat suodatettiin alleelisuhteella, joka oli alle 0,8 (heterotsygoottinen), ja peitettiin alle 3 tai yli 150 lukemalla. Nämä vaiheet pienensivät merkittävästi luetteloa, mikä johti 10 794 oletettuun muunnokseen, joille tehtiin lisäanalyyseja.

Sequenom-, PyroSequencing- ja Sanger-sekvensointien avulla validoimme kaikki koodausvaihtoehdot ja osan ei-koodaavista muunnoksista, joka sisälsi 762 SNP: tä ja 169 pientä indeliä. Määritykset suoritettiin käyttäen neljän C57BL / 6J- ja neljän C57BL / 6N-näytteen paneelia genotyyppien vahvistamiseksi (katso Materiaalit ja menetelmät). Pidimme varianttia validoituna, kun kaikki neljä C57BL / 6J- ja C57BL / 6N-näytettä osoittivat johdonmukaisia genotyyppejä alikannassa ja variantteja alikantojen välillä. Vahvistusprosessin aikana eliminoimme 363 muunnosta useista syistä, mukaan lukien heterotsygoottiset ja epäjohdonmukaiset genotyypit ja PCR-epäonnistumiset. Jäljelle jääneille 568: lle 236 vahvistettiin muunnoksena alikantojen välillä (katso lisätiedosto 1, taulukko S1).

Genominen sijainti ja muut geenitekijät määritettiin käyttämällä annotointiohjelmia NGS-SNP ja Annovar. tutkittu. Lopulliset validoidut sekvenssivariantit C57BL / 6J: n ja C57BL / 6N: n välillä koostuivat 34 koodaavasta SNP: stä, 2: sta koodaavasta pienestä indeksistä, 146: sta koodaamattomasta SNP: stä ja 54: stä koodaamattomasta pienestä indelistä. Koodaavat variantit sisälsivät 32 missense SNP: tä, 1 hölynpölymutaation, 1 silmukointimutaation ja 2 kehyksensiirtomutaatiota (taulukko 1). Huomasimme, että kaikki variantit yhtä lukuun ottamatta (Zp2, kromosomi 7) olivat yksityisiä joko C57BL / 6J: lle tai C57BL / 6N: lle, eikä niitä löytynyt missään 16 muusta äskettäin sekvensoidusta sisäsiitoskannasta.

C57BL / 6N- ja C57BL / 6J-hiirten genomisekvenssivertailut rakenteellisille muunnoksille

Jälleen käyttämällä 17 hiiren genomiprojektista tuotettuja pariliitoksen lukemia ja neljän laskennallisen yhdistelmän käyttöä Menetelmillä tunnistimme 551 SV: tä C57BL / 6J: n ja C57BL / 6N: n välillä. Kuten muualla on kuvattu, tarkastimme silmämääräisesti lyhytaikaisen pariliitoksen kartoituksen näissä 551 SV-kohdassa 17 sekvensoidussa sisäsiitoshiirikannassa ja Broad J -sekvensoidussa genomissa. Tekemällä tämän, pystyimme säilyttämään 81 551: stä paikasta jatkokokeiden analyysejä varten (470 ennustettua paikkaa todettiin vääriksi pariliitospään kartoitusvirheiden vuoksi). PCR- ja Sanger-pohjaiset sekvensointianalyysit näissä 81 pidätetyssä paikassa antoivat meille mahdollisuuden poistaa vielä 38 kohtaa, joiden C57BL / 6J: n ja C57BL / 6N: n välillä todettiin olevan ei-polymorfisia vertailuvirheiden takia. Lopuksi kaikki 43 ennustettua varianttia validoitiin autenttisina SV-yksiköinä, jotka erottivat C57BL / 6J- ja C57BL / 6N-kannat (taulukko 2), mikä johti nollaan väärän positiivisen määrän.

43 SV: stä 15 päällekkäin geenin kanssa (taulukko 2), mukaan lukien 12 muunnosta, jotka sijaitsevat geenien koodaamattomilla alueilla, 2 muunnosta, jotka vaikuttavat geenin koodaavaan alueeseen (Vmn2r65 (Vomeronasal 2, reseptori 65) ja Nnt (nikotiiniamidinukleotiditranshydrogenaasi)) ja 1, joka vaikuttaa koko geeniin Cyp2a22 (sytokromi P450, perhe 2, alaryhmä a, polypeptidi 22). Vain yksi 15 muunnoksesta tunnetaan ja se on jo liitetty fenotyyppiin Nnt; loput 14 ovat uusia, ja useiden osalta keskustelemme niiden mahdollisista biologisista toiminnoista jäljempänä.

Käyttämällä rotaa ulkoryhmälajina päätimme seuraavaksi 43 SV: n alkuperän C57BL / 6J: n ja C57BL / 6N: n välillä, ja havaitsi, että 27 muunnosta oli uudelleensijoittamisen tuote, 15 oli toistumattomasti välittyviä SV: itä ja 1 oli vaihtelevan lukumäärän tandemtoisto (VNTR) (taulukko 2). On huomattavaa, että melkein kaikki variantit olivat yksityisiä joko C57BL / 6J: lle tai C57BL / 6N: lle (taulukko 2).

C57BL / 6N- ja C57BL / 6J-hiirten kattava fenotyyppiarviointi

Rinnakkain genomianalyysien perusteella European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) -konsortio on suorittanut kattavan fenotyyppisen vertailun C57BL / 6NTac- ja C57BL / 6J-kannoista. EUMODIC koostuu neljästä hiirikeskuksesta, jotka suorittavat laajamittaisen 500 hiiren mutanttipoistolinjan ensisijaisen fenotyyppityypin, jotka on luotu Euroopan ehdollisen hiiren mutageneesi (EUCOMM) – ja Knockout Mouse (KOMP) -hankkeista IKMC-ohjelman puitteissa. Hiirien kohortit kustakin mutanttilinjasta saapuvat European Mouse Phenotyping Resource of Standardized Screens slim (EMPReSSslim) -fenotyyppiarviointiin, joka koostuu kahdesta fenotyyppiputkesta, jotka käsittävät 20 fenotyyppialustaa (tunnistettu ESLIM__procedure_number), jotka suoritetaan 9-15 viikon aikana (katso lisätiedosto 2, kuva S1). Menetelmät kunkin näytön suorittamiseksi on kuvattu vakiotoimintamenettelyissä (SOP), jotka löytyvät EMPReSS-tietokannasta. Tiedot kerättiin 413 fenotyyppiparametrista yhdessä 146 metatietoparametrin kanssa ja syötettiin EuroPhenome-tietokantaan. Osana tätä työtä olemme siepanneet laajat kontrollitiedot C57BL / 6NTac: n perustason fenotyypistä. Olemme myös käyttäneet tilaisuutta tutkia C57BL / 6J-hiirten fenotyyppiä ja verrata sitä C57BL / 6NTac: iin (tästä lähtien kutsutaan vastaavasti J: ksi ja N: ksi).

Jokaisella rivillä N ja J, ikä – yhteensopivat hiiret on analysoitu molempien EMPReSSslim-putkistojen kautta. Tiedot saatiin konsortion kaikista neljästä keskuksesta 19 putkilinjan 20 alustasta, lukuun ottamatta fluoresenssiaktivoitujen solujen lajittelun (FACS) analyyseja (katso lisätiedosto 2, kuva S1). EMPReSSslim-protokollat on standardoitu tiukasti EUMODIC-konsortiossa; esimerkiksi laitteissa ja ruokavaliossa on kuitenkin edelleen eroja, ja tämä on otettu huomioon EuroPhenomen metatietojoukoissa. Keskusten välillä on tietysti muita tunnustamattomia ympäristöeroja. Yhdessä nämä voivat vaikuttaa geeniympäristöeroihin ja fenotyyppituloksiin, mutta emme pyrkineet määrittelemään näitä vaikutuksia systemaattisesti, sen sijaan keskitymme fenotyyppeihin, jotka ovat keskusten kesken yhtäpitäviä ja selvästi vankkoja tuntemattomille ympäristöhäiriöille. Kunkin keskuksen N- ja J-kohortin tiedot talletettiin EuroPhenomeen, ja niille on tehty tilastollinen analyysi kustakin keskuksesta (katso Materiaalit ja menetelmät). On tärkeää huomata tässä, että vertailut N: n ja J: n välillä tehtiin keskusten sisällä, ei keskusten välillä. Keskusten välisten tulosten tilastollista analyysiä ei suoritettu, koska kokeita ei voitu täysin hallita keskusten välillä ympäristö- ja muiden muuttujien sekä kussakin keskuksessa analysoitujen eläinten lukumäärän vuoksi (katso lisätiedosto 3, kuva S2a-d). Valitsimme siten lähestymistavan, joka keskittyi kantojen vertailuihin yksittäisissä keskuksissa sen sijaan, että luotiin monikeskustilastomalli, jossa tutkittiin kahden kannan välistä tilastollista eroa. N- ja J-vertailun replikointi useiden keskusten välillä toi kuitenkin meille lisää voimaa perustellessaan merkittäviä fenotyyppisiä eroja kahden kannan välillä. N: n ja J: n analyysin lisäksi EMPReSSslim-primaarisen fenotyyppiputken kautta neljässä keskuksessa muut EUMODIC-konsortion kumppanit ovat soveltaneet laajempaa valikoimaa usein kehittyneempiä fenotyyppitestejä lisätietojen keräämiseksi, joista osa tutkii edelleen ja pyrkii perustella EMPReSSslimillä paljastetut fenotyyppiset erot.

Analysoimalla tietoja keskityimme ensin sellaisten fenotyyppiparametrien tunnistamiseen, jotka osoittivat johdonmukaisen ja merkittävän eron N: n ja J: n välillä kolmessa tai useammassa keskuksessa.Tunnistimme 27 fenotyyppiparametriä tässä luokassa (kuva 1a; katso lisätiedosto 3, kuva S2a, e). Useissa tapauksissa toissijaisen analyysin tiedot tukivat näitä eroja, ja keskustelemme näistä tapauksista jäljempänä. Löysimme myös toisen luokan parametrit, joiden samanlaiset suuntaukset havaittiin kahdessa keskuksessa, mutta muissa kahdessa keskuksessa ei havaittu todisteita suuntauksista (kuva 1b; katso lisätiedosto 3, kuva S2b, f). Tilastollinen analyysimme (katso Materiaalit ja menetelmät) osoittaa kuitenkin, että tälle parametriluokalle N: n ja J: n erojen yleinen merkitys on pieni ja havaittuihin suuntauksiin on suhtauduttava varoen. Useissa näistä tapauksista havaitut suuntaukset ovat kuitenkin yhdenmukaisia fenotyyppien kanssa, jotka löytyvät ensimmäisestä parametriluokasta. Tunnistimme myös kolmannen mutta pienen parametriluokan, jolla oli erittäin merkittäviä eroja kahdessa tai useammassa keskuksessa (kuva 2; katso lisätiedosto 3, kuva S2d, h), mutta yllättäen päinvastainen suuntaus yhdessä keskuksista. Keskustelemme näiden poikkeavuuksien syistä, jotka joissakin tapauksissa johtuvat oletettavasti geenikeskusten vuorovaikutuksista. Viimeinen luokka edustaa suurta määrää testejä, joissa emme havainneet yhteneviä ja merkittäviä eroja keskusten välillä, ja pääteltiin, että nämä ovat todennäköisemmin vääriä positiivisia eikä todisteita N / J-eroista (katso lisätiedosto 3, kuva S2c , g).

Dysmorfologia ja oftalmologia

Emme löytäneet todisteita merkittävistä eroista morfologisissa ominaisuuksissa N: n ja J: n välillä, mukaan lukien luuston röntgenanalyysi. Kahden kannan välillä tunnistettiin kuitenkin useita oftalmologisia eroja. Analysoimalla yleisiä visuaalisia toimintoja virtuaalisen optokineettisen rummun avulla havaittiin heikentynyt näkö N: ssä verrattuna J-hiiriin (N: 0,314 sykliä / aste, 95%: n luottamusväli 0,305 – 0,323, n = 89; J: 0,399 sykliä / aste, 95% CI 0,394 arvoon 0,404, n = 128; p < 0,001, Studentin t-testi). Tämä ei heijastanut linssin opasiteettien eroja, koska kvantitatiivinen analyysi Scheimpflug-kameralla löysi läpinäkyviä linssejä molemmat kannat (N: 5,2 + 0,5%, n = 10; J: 5,0% + 0,5% opasiteetti, n = 10). N-hiiren pohjassa havaittiin suuria taajuuksia valkoisia pilkkuja, joita ei esiintynyt J-hiirissä ( Tämä johtuu todennäköisesti Crb1rd8-mutaation läsnäolosta N-hiiressä, kuten aiemmin on raportoitu, vaikka tapauksessamme pilkkuja havaittiin vain vatsakalvossa, hiirien välisen fleckin koon ja vaikutusalueen vaihteluilla (kuva 3A) Lisätutkimukset, joissa käytettiin ajankohtaista silmänpohjan endoskopiaa, osoittivat, että pääverisuonten lukumäärä vaihteli, vaihteli kolmeen seitsemään laskimoon ja kolmeen ja eigiin ht valtimoille (kuva 3B), ja tietyllä hiirellä voi olla ei-yhteensopivia numeroita kahden silmän välillä. Sekä laskimoiden että valtimoiden keskimääräinen lukumäärä oli merkittävästi suurempi (P < 0,001) J: ssä kuin N hiiressä (kuva 3C).

Sydän- ja verisuonitaudit

Ei-invasiiviset verenpainemittaukset (ESLIM_002) osoittivat, että systolinen valtimopaine oli merkittävästi korkeampi J: ssä kuin N-hiirissä, vaikka vaikutuksen merkityksen havaittiin vaihtelevan sukupuolten ja keskusten välillä. Lisäksi kaikki keskukset havaitsivat, että pulssi oli huomattavasti korkeampi N: ssä kuin J-hiirissä.Toissijainen kumppani konsortiossa havaitsi kuitenkin, että anestesia-ajan syke oli huomattavasti pienempi N: ssä kuin J-uroshiirissä, mikä heijastui pitkään lyöntien väliseen (RR) ja QTc-aikaan. Havaitsimme myös, että sääriluun pituuteen normalisoitu sydämen paino (ESLIM_020) oli merkittävästi pienempi N: ssä kuin J-hiirissä kahdessa keskuksessa, ja nämä tulokset vahvistettiin toisistaan riippumatta toissijaisella analyysillä. Lisätutkimukset sydämen rakenteesta ja toiminnasta kaikukardiografialla ja sydämen supistumisfunktiosta hemodynamiikan avulla eivät paljastaneet mitään eroja N: n ja J: n välillä (tietoja ei esitetty).

Metabolia

Epäsuorien kalorimetristen mittausten osalta vapaana syötetyistä hiiristä (ESLIM_003), havaitsimme johdonmukaisen eron N: n ja J: n välillä O2: n kulutuksessa, CO2: n tuotannossa ja lämmöntuotannossa. J-hiirillä oli vähentynyt kaasunvaihto ja pienemmät energiankulutukset (lämmöntuotanto tai aineenvaihdunnan nopeus) verrattuna N: ään, mikä oli yleensä voimakkaampaa naisilla. Paikallisella epäsuoralla kalorimetrialla tehdyissä sekundäärisissä fenotyyppeissä havaittiin suuntaus pienempään energiankulutukseen J: ssä N: ään nähden yöllä. Tähän liittyi mahdollisesti vähentynyt avohoidon aktiivisuus J: ssä ja alhaisempi ruoan saanti J: ssä verrattuna N: ään yöllä, etenkin uudelleen ruokinnan yhteydessä (tietoja ei esitetty). Ei ollut johdonmukaista eroa aktiivisuudessa vapaasti syötetyssä kalorimetrianäytössä (ESLIM_003) kahdessa keskuksessa, joissa aktiivisuus mitattiin (katso lisätiedosto 3, kuva S2c, g). Yksinkertaistetut vatsakalvonsisäiset glukoositoleranssitestit (IPGTT) (ESLIM_004) osoittivat heikentynyttä glukoositoleranssia J vs. N hiirillä. Nämä havainnot glukoosimetaboliasta ovat yhdenmukaisia J-hiirille spesifisen Nnt-geenin tunnetun deleetion kanssa, jolla on osoitettu olevan rooli haiman beetasolujen insuliinivasteen säätelyssä.

Kaksoisenergia X Rakeiden absorptiometrian (DEXA) kehon koostumus ja luun densitometriamittaukset (ESLIM_005) osoittivat, että N-hiirellä on lisääntynyt rasvamassa (sekä absoluuttinen että normalisoitu painon mukaan). Lisäksi DEXA-mittaukset osoittivat, että J-hiirillä on kasvanut vähärasvainen massa kuin N.: ssä. Kahdessa keskuksessa luun mineraalitiheyden mittaukset olivat korkeammat J-uroshiirillä; Tätä havaintoa ei kuitenkaan toistettu kolmannessa keskuksessa, joka teki DEXA-näytöt. Jatkimme kahden kannan mikrotietokonetomografian (μCT) analyysiä (kuva 4) ja havaitsimme, että kortikaalinen paksuus, aivokuoren huokoisuus ja trabekulaarisen luun tilavuus eivät muuttuneet N: n ja J.: n välillä. Lisäksi erilaisten mikroarkkitehtuurien analyysi parametrit osoittivat, että koko trabekulaarinen verkko oli samanlainen. Lopuksi luun muodostumisen ja resorptiomerkkien mittaaminen ei paljastanut mitään eroja kahden kannan välillä (kuva 4).

Neurologiset, käyttäytymis- ja aistinvaraiset

Kaksi keskusta osoitti suuria ja johdonmukaisia eroja N: n ja J: n välillä aktiivisuudessa avoimessa kentässä (ESLIM_007) (kuva 2), mukaan lukien suurempi aktiivisuus J-hiirissä kuljetun matkan perusteella mitattuna ja suurempi keskipisteiden määrä, mikä viittaa vähentyneeseen ahdistukseen. Nämä erot ovat yhdenmukaisia äskettäin raportoitujen tietojen kanssa N: n ja J: n käyttäytymisvertailusta. Mielenkiintoista on, että merkittävimmät vaikutukset rajoittuivat miehiin molemmissa keskuksissa. Yllättäen kolmannessa keskuksessa nähtiin päinvastainen, N hiiren ollessa aktiivisempia kuin J, vaikka nämä vaikutukset havaittiin sekä miehillä että naisilla. Neljäs keskus ei havainnut näitä vaikutuksia eikä löytänyt merkittäviä eroja. Kaikki keskukset käyttivät menettelyyn EMPReSSslim SOP -menetelmää, joka sisälsi vaatimuksen samankokoisille areenoille, mutta keskusten välillä oli joitain toiminnallisia eroja, mukaan lukien yhden tai useamman huoneen käyttö areenoiden sijoittamiseen; läpinäkyvät tai läpinäkymättömät areenat; ja ympäristön rikastamisen puuttuminen tai esiintyminen kotihäkissä (jonka tiedetään vaikuttavan käyttäytymistuloksiin). Mikään näistä muuttujista ei kuitenkaan ollut yhdenmukainen keskusten erilaisten havaintojen kanssa.Emme kuitenkaan voi sulkea pois suolen mikrobiomin vaikutuksia, joiden voidaan odottaa vaihtelevan keskusten välillä. Suolen mikrobiomin tiedetään vaikuttavan keskushermoston toimintaan ja käyttäytymiseen, pääasiassa hypotalamuksen, aivolisäkkeen ja lisämunuaisen akselin kautta. Päätelmämme on, että tietyissä olosuhteissa N- ja J-alueiden välillä voidaan nähdä merkittäviä eroja avoimen kentän parametreissa, mutta näiden erojen luonne on herkkä tuntemattomille ympäristöolosuhteille. On mielenkiintoista, että N- ja J-fenotyyppien suurin ristiriitainen havainto rajoittui käyttäytymisen fenotyyppien muodostamisalustaan. Sitä vastoin useimmissa muissa testeissä (lukuun ottamatta muutamia hematologisia ja kliinisiä kemiallisia parametreja, katso alla), emme löytäneet epäjohdonmukaisuuksia, mikä osoittaa, että käyttäytymisanalyysit voivat olla akuutti herkkiä ympäristöparametreille, toisin kuin useimmat fenotyyppialustat.

Suoritimme myös vaalean / tumman siirtymätestin verrattaessa ahdistusta N- ja J-kannoissa (kuva 5). Emme löytäneet merkittäviä eroja N- ja J-hiirten välillä vaalean ja tumman siirtymien määrässä tai pimeässä osastossa vietetyn ajan prosenttiosuudessa. Latenssi päästä pimeään osastoon oli kuitenkin huomattavasti korkeampi N-hiiressä. Muokattu SHIRPA (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phenotype Assessment) -testi (ESLIM_008, kuva 1a) kaikissa neljässä keskuksessa osoitti, että urospuolisilla J-hiirillä oli merkittävästi lisääntynyt liikkumisaktiivisuus, mikä korreloi lisääntyneen matkan havaintojen kanssa. avoimen kentän testaus joissakin keskuksissa (katso yllä).

Teimme useita testejä, jotka heijastavat motorista kykyä. Eroa pitolujuudessa (ESLIM_009) havaittiin kaikissa keskuksissa, joissa J oli korkeampi kuin N, mutta parametrit, joihin vaikutukset vaikuttivat, olivat erilaisia, ja jotkut keskukset ilmoittivat eturaajan pito-lujuuden eroja ja toiset etu- ja takaraajan pito-lujuuden yhdessä (kuva 1a , b). Rotarod-testaus (ESLIM_010) osoitti merkittäviä eroja latenssin pudotuksessa kaikissa keskuksissa, vaikka N: n heikentynyt motorinen kyky havaittiin vain naisilla kahdessa keskuksessa. Tutkimme edelleen motorisia kykyjä N- ja J-urospuolisissa hiirissä tutkimalla motorisen oppimisen suorituskykyä rotarodilla neljän päivän aikana (kuva 5). Vaikka J-hiirten motorinen suorituskyky parani huomattavasti päivästä 1 päivään 2, N-hiirten suorituskyky parani vain vähitellen ja oli merkittävästi erilainen kuin ensimmäisen päivän mittaukset vasta päivästä 3 (P < 0,05) eteenpäin. Lisäksi päivästä 2 päivään 4 putoamisviiveessä oli erittäin merkittäviä eroja N: n ja J: n välillä. Keskuksissa suoritettu primaarinen testaus paljasti siten potentiaalisen heikentyneen moottorin suorituskyvyn N: ssä, mikä vahvistettiin ja kehitettiin edelleen kehittyneemmällä testauksella. moottorin oppimisen suorituskyvystä.

Suoritimme myös kaksi ylimääräistä käyttäytymistestiä N- ja J-erojen edelleen kehittämiseksi. Ensinnäkin verrattiin N: n ja J: n suorituskykyä Morrisin vesisokerotestissä, jota käytettiin avaruusmuistin arviointiin. N urospuolisella hiirellä suorituskyky oli heikentynyt huomattavasti (korkeampi latenssi) verrattuna J-uroshiiriin (kuvio 6). Toiseksi tutkimme tunneperäistä oppimista tai muistia vastenmielisestä tapahtumasta käyttämällä vihje- ja asiayhteyteen perustuvia pelkoehdostestejä; tässä ei kuitenkaan löytynyt merkittäviä eroja näiden kahden kannan välillä (tietoja ei esitetty).

Akustisen hätkähdyksen ja pulssin esiasteiden esto (ESLIM_011) (kuva 1a) kahdessa kannassa tunnistivat useita parametreja jotka olivat merkittävästi ja jatkuvasti erilaisia keskusten välillä. Hätkähdyksen akustinen voimakkuus 110 dB: llä ja hätkähdytysvasteen suuruus esipulssiin ja pulssiin (PP1-PP4 + pulssi, katso EMPReSSslim) pieneni N: ssä verrattuna J: hen, vaikka tätä vaikutusta ei havaittu yhden keskuksen naisilla. Näiden havaintojen mukaisesti havaitsimme, että pulssia edeltävä esto poikkesi N: stä J: stä, ennen pulssin estämistä PP2: lla ja PP3: lla ja globaali inhibitio lisääntyi N: ssä verrattuna J.: iin. Useat muut hätkähdysasteet ja pulssia edeltävät estoparametrit osoittivat merkittäviä vaikutuksia yksi tai kaksi keskusta (kuva 1b; katso lisätiedosto 3, kuva S2b, f), mutta muissa keskuksissa ei havaittu eroja. Hätkähdysasteen havainnot eivät hämmentäneet kuuloeroja, koska arvioimme kuulokynnykset sekä J- että N-hiirissä kuulotutkimuksen aivorungon vastetestiä käyttäen, emmekä löytäneet eroja (tietoja ei esitetty).

Kliininen kemia

Laajat kliinisen kemian testien paneelit tehtiin plasmanäytteistä, jotka oli kerätty kunkin fenotyyppiputken päässä. Verinäyte putkilinjan 1 päässä (ESLIM_021) kerättiin yön yli paaston jälkeen, kun taas näyte putkilinjan 2 lopussa (ESLIM_015) oli vapaasti syötetystä eläimestä.Ainakin kolmesta keskuksesta sopivat tiedot osoittivat, että urea ja elektrolyytit, natrium, kalium ja kloridi olivat merkitsevästi suurempia J-hiirten plasmassa kuin N-hiirissä (kuvio 1a), vaikka sukupuolikeskuksen vuorovaikutuksia oli joitain. Tiedot vapaasti syötetyistä ja paastoamattomista plasman glukoosipitoisuuksista osoittivat, että kussakin testissä ainakin kaksi keskusta havaitsi plasman glukoosipitoisuuden olevan korkeampi N: ssä kuin J-hiirissä (kuvio 1b). Eläinten käsittely, näytteiden käsittely ja anestesia-aineiden tiedetään kuitenkin vaikuttavan verensokeritasoihin. Tässä esitetyt tiedot ovat kaikki näytteistä, jotka on kerätty kaasumaisessa isofluoraanipuudutuksessa, lukuun ottamatta yhtä keskusta, johon näytteet kerättiin ketamiini / ksylatsiini-injektiolla (katso kuvio 1). Kuten edellä keskusteltiin, tuntuu olevan ristiriitaista, koska J-hiirillä tiedetään olevan heikentynyt insuliinierityksen häiriö, koska plasman glukoosipitoisuus on matalampi kuin N-hiirillä, mutta Nnt: n deleetio näyttää vaikuttavan vain glukoosin puhdistumisnopeuksiin ja paastoamattomiin tai altistamattomiin J-hiiriin. sinulla ei ole jatkuvaa hyperglykemiaa. Useiden muiden parametrien osoitettiin olevan korkeammat J: ssä kuin N-hiirissä vähintään kahdessa keskuksessa, mutta kussakin tapauksessa muut keskukset eivät ilmoittaneet merkittäviä eroja samoissa parametreissä (kuvio 1b), esimerkiksi vapaissa rasvahapoissa. Kaksi keskusta havaitsi, että rauta oli merkittävästi korkeampi N-miehillä ja että alkalinen fosfataasi oli merkittävästi korkeampi J-miehillä. Yksi näistä keskuksista havaitsi saman olevan totta myös naisilla (kuva 2). Kuitenkin näiden kolmen parametrin tiedot kolmannesta keskuksesta ovat ristiriidassa näiden havaintojen kanssa.

Hematologia

Eri hematologisia parametreja mitattiin putkilinjan 2 lopussa (ESLIM_016). Kaksi keskusta löysi merkittäviä muutoksia useissa parametreissä, mutta näitä tuloksia ei toistettu muissa, mukaan lukien valkosolujen ja punasolujen määrä, keskimääräinen solutilavuus ja keskimääräinen korpuskulaarinen hemoglobiini (kuvio 1b). Hematokriitti- ja keskimääräisten solujen hemoglobiinikonsentraatiotesteissä saatiin ristiriitaiset tulokset (kuvio 2). Kummassakin tapauksessa kahden keskuksen tiedot olivat yhtä mieltä, kun taas kolmannessa keskuksessa oli päinvastainen vaikutus. Tämä saattaa johtua metatietoihin kirjatusta erilaisista konetekniikoista, joita käytetään hematologisiin mittauksiin osallistuvissa klinikoissa.

Immuunitoiminto ja allergia

Tutkimme useita sekundaarisia fenotyyppejä mukaan lukien isännän resistenssi Listeria monocytogenesille J- ja N-kannoissa. Molempien kantojen naiset olivat herkempiä L. monocytogenes -infektiolle; sukupuoliero Listeria-isäntäherkkyydessä oli kuitenkin vähemmän selvä N: ssä kuin J. N-kannan miehillä Listerian puhdistuma lisääntyi infektion jälkeisenä päivänä 4 verrattuna J-uroksiin. Tämä korreloi lisääntyneen tulehdusta ehkäisevän vasteen kanssa N-miehillä infektion jälkeisenä päivänä 3. päivänä verrattuna J-miehiin (kuva 7).

Testasimme myös N- ja J-hiiriä dinitrofluoribentseenin (DNFB) aiheuttama kosketusyliherkkyys (CHS). Kahden hiiren kannan välillä tunnistettiin merkittävät erot CHS-vasteessa, J: n ollessa lisääntynyt CHS-vaste. Huomattavasti molempien kantojen naaraspuolisilla hiirillä oli lisääntynyt CHS verrattuna uroshiiriin. Luonnollisten tappajasolujen (NK) reaktiokyvyn tutkimus erilaisiin ärsykkeisiin osoitti, että suurempi osa NK-soluista aktivoituu yksin interleukiini (IL) -12: lla tai yhdessä IL-2: n kanssa J: ssä verrattuna N hiiriin; tämä vaste oli jälleen merkittävämpi naisilla (kuvio 8).