C57BL / 6JおよびC57BL / 6Nマウス系統の表現型とゲノムの比較分析

SNPおよび小さなインデルに対するC57BL / 6NおよびC57BL / 6Jマウスのゲノム配列の比較

17 Mouse Genomes Projectのリファレンスゲノム（C57BL / 6J）に対するC57BL / 6Nのペアエンドアラインメントを利用しました。ただし、正確な推定配列変更を識別する可能性を高めるために、2つのゲノム間の分化バリアント（SNP、小さなインデル、およびSV）のリストは、新しい組み込み手順を使用して新しく作成されました。アラインメントから高品質のバリアントセットを特定するための重要な分析ステップは、BroadInstituteによって生成されたC57BL / 6Jの新しく生成されたショートリードゲノム配列を利用することでした。これにより、参照シーケンスのアセンブリエラーを特定できました。さらに、バリアントの検出方法を更新しました。まず、さまざまなソフトウェアやより進化したソフトウェアを使用してバリアントを検出します。 2つ目は、すべてのコーディングバリアントに対して手動キュレーションを実行すること、3つ目は、大部分のバリアント（すべてのコーディングバリアントを含む）を広範囲に検証して、シーケンスの予測を確認することです。これらの手順により、高品質のコーディングバリアントの堅牢なデータセットが提供され、偽陽性率が大幅に減少しました。

C57BL / 6J株とC57BL / 6N株を区別するSNPと小さなインデルを特定するために、ペアエンドタグを使用しました。 17 Mouse GenomesProjectから生成された読み取りを終了します。 Genome Analysis Toolkit（GATK）を使用してバリアントを呼び出し、C57BL / 6J株とC57BL / 6N株を区別する681,220のバリアントを見つけました。 BroadInstituteによって生成されたC57BL / 6Jのショートリードゲノム配列を使用して、Broad C57BL / 6J配列に共通するバリアントを削除することにより、予想されるシーケンスエラーを除外し、偽陰性を改善しながらリファレンスの不一致を打ち消すことができました。割合。残りのリードは、0.8未満（ヘテロ接合）の対立遺伝子比でフィルタリングされ、3未満または150を超えるリードでカバーされました。これらの手順によりリストが大幅に削減され、10,794の推定バリアントがさらに分析されました。

Sequenom、PyroSequencing、およびSangerシーケンスを使用して、すべてのコーディングバリアントと非コーディングバリアントのサブセットを検証しました。これには、762のSNPと169の小さなインデルが含まれていました。遺伝子型を確認するために、4つのC57BL / 6Jおよび4つのC57BL / 6Nサンプルのパネルを使用してアッセイを実施しました（材料と方法を参照）。 4つのC57BL / 6JおよびC57BL / 6Nサンプルすべてがサブ株内で一貫した遺伝子型を示し、サブ株間でバリアントを示した場合に、バリアントを検証することを検討しました。検証プロセス中に、ヘテロ接合で一貫性のない遺伝子型やPCRの失敗など、さまざまな理由で363のバリアントを排除しました。残りの568については、236が亜株間の変異として確認されました（追加ファイル1、表S1を参照）。

アノテーションプログラムNGS-SNPおよびAnnovarを使用して、ゲノム位置およびその他の遺伝子機能は調べた。 C57BL / 6JとC57BL / 6Nの間の最終的に検証された配列バリアントは、34個のコーディングSNP、2個のコーディングスモールインデル、146個の非コーディングSNP、および54個の非コーディングスモールインデルで構成されていました。コーディングバリアントには、32のミスセンスSNP、1つのナンセンス変異、1つのスプライシング変異、および2つのフレームシフト変異が含まれていました（表1）。 1つ（Zp2、ゲノム7）を除くすべてのバリアントは、C57BL / 6JまたはC57BL / 6Nのいずれかにプライベートであり、最近シーケンスされた他の16の近交系のいずれにも見つかりませんでした。

C57BL / 6NマウスとC57BL / 6Jマウスの構造変異体のゲノム配列比較

ここでも、17マウスゲノムプロジェクトから生成されたペアエンドリードと4つの計算の組み合わせを使用しますメソッドでは、C57BL / 6JとC57BL / 6Nの間で551個のSVを識別しました。他の場所で説明されているように、17のシーケンスされた近交系マウスとBroadJシーケンスされたゲノムのこれらの551SVサイトでショートリードペアエンドマッピングを視覚的に検査しました。これを行うことにより、さらなる実験分析のために551サイトのうち81サイトを保持することができました（ペアエンドマッピングエラーのために470の予測サイトが偽であることが判明しました）。これらの81の保持されたサイトでのPCRおよびサンガーベースのシーケンス分析により、さらに38のサイトを削除することができました。これらのサイトは、参照エラーのためにC57BL / 6JとC57BL / 6Nの間で非多型であることが確認されました。最後に、43の予測されたバリアントすべてが、C57BL / 6J株とC57BL / 6N株を区別する本物のSVとして検証され（表2）、偽陽性率はゼロになりました。

43個のSVのうち、15個が遺伝子と重複しています（表2）。これには、遺伝子の非コード領域内にある12個のバリアント、遺伝子のコード領域に影響を与える2個のバリアント（Vmn2r65）が含まれます。 （鋤鼻器2、受容体65）およびNnt（ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ））、および遺伝子Cyp2a22全体に影響を与える1（チトクロームP450、ファミリー2、サブファミリーa、ポリペプチド22）。 15のバリアントのうち1つだけが既知であり、表現型Nntにすでに関連付けられています。残りの14は新規であり、いくつかについて以下でそれらの潜在的な生物学的機能について説明します。

次に、ラットを外群種として使用して、C57BL / 6JとC57BL / 6Nの間の43のSVの起源を推測しました。そして、27のバリアントがレトロトランスポゾンの産物であり、15が非リピート媒介SVであり、1が可変数タンデムリピート（VNTR）であることがわかりました（表2）。注目すべきことに、ほとんどすべてのバリアントはC57BL / 6JまたはC57BL / 6Nのいずれかにプライベートでした（表2）。

C57BL / 6NおよびC57BL / 6Jマウスの包括的な表現型評価

ゲノム解析であるEuropeanMouse Disease Clinic（EUMODIC）コンソーシアムは、C57BL / 6NTac株とC57BL / 6J株の包括的な表現型比較を実施しました。 EUMODICは、IKMCプログラム内のEuropean Conditional Mouse Mutagenesis（EUCOMM）およびKnockout Mouse（KOMP）プロジェクトから生成された500のマウス変異体ノックアウトラインの広範な一次表現型を実行する4つのマウスセンターで構成されています。各変異株からのマウスのコホートは、9〜15週間実行される20の表現型プラットフォーム（ESLIM__procedure_numberで識別）を含む2つの表現型パイプラインで構成される標準化スクリーンスリム（EMPReSSslim）表現型評価のヨーロッパマウス表現型リソースに入力されます（追加ファイル2、図S1を参照）。各画面を実行する方法は、EMPReSSデータベースにある標準操作手順（SOP）で詳しく説明されています。データは、146のメタデータパラメーターとともに413の表現型パラメーターで取得され、EuroPhenomeデータベースに入力されました。この作業の一環として、C57BL / 6NTacのベースライン表現型に関する広範な制御データを収集しています。また、この機会を利用して、C57BL / 6Jマウスの表現型を調査し、これをC57BL / 6NTac（以降、それぞれJおよびNと呼びます）と比較しました。

各系統、NおよびJについて、年齢-一致したマウスは、両方のEMPReSSslimパイプラインを介して分析されています。パイプラインからの20のプラットフォームのうち19について、コンソーシアムの4つのセンターすべてからデータを取得しました。ただし、蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析は除きます（追加ファイル2、図S1を参照）。 EMPReSSslimプロトコルは、EUMODICコンソーシアムで厳密に標準化されています。ただし、機器や食事などにはいくつかの違いが残っており、これはEuroPhenome内のメタデータセットに取り込まれます。もちろん、センター間には他にも認識されていない環境の違いがあります。まとめると、これらは遺伝子環境の違いと表現型の結果に寄与する可能性がありますが、これらの効果を体系的に定義しようとはせず、代わりに、中心間で一致し、認識されていない環境の摂動に対して明らかに堅牢な表現型に焦点を当てました。各センターのNおよびJコホートからのデータは、EuroPhenomeに保管され、各センターの統計分析にかけられました（材料と方法を参照）。ここで重要なのは、NとJの比較は、センター間ではなく、内部で行われたということです。環境やその他の変数、および各センターで分析された動物の数の違いのために、実験をセンター間で完全に制御できなかったため、センター間の結果の統計分析は実行されませんでした（追加ファイル3、図S2a-dを参照）。したがって、2つの株間の全体的な統計的差異を調べる多施設統計モデルを生成するのではなく、個々の施設内の株比較に焦点を当てたアプローチを採用することを選択しました。ただし、複数のセンター間でのNとJの比較の複製により、2つの株間の有意な表現型の違いを実証するための追加の力が得られました。 4つのセンターでのEMPReSSslimプライマリ表現型パイプラインによるNとJの分析に加えて、EUMODICコンソーシアム内の他のパートナーは、追加情報を収集するために、より広範囲の、多くの場合より洗練された表現型テストを適用しました。 EMPReSSslimを通じて明らかにされた表現型の違いを実証します。

データの分析では、最初に3つ以上のセンターでNとJの間に一貫した有意差を示した表現型パラメーターの特定に焦点を当てました。このクラスで27の表現型パラメーターを特定しました（図1a。追加ファイル3、図S2a、eを参照）。いくつかのケースでは、これらの違いは二次分析からのデータによってサポートされていました。これらのインスタンスについて以下で説明します。また、2つのセンターで同様の傾向が見られたが、他の2つのセンターでは傾向の証拠が見られなかった2番目のクラスのパラメーターを発見しました（図1b;追加ファイル3、図S2b、fを参照）。ただし、統計分析（材料と方法を参照）では、このクラスのパラメーターの場合、NとJの差の全体的な有意性は低く、観察された傾向は注意して扱う必要があります。ただし、これらのケースのいくつかでは、観察された傾向は、パラメーターの最初のクラスで見つかった表現型と一致しています。また、2つ以上のセンターで非常に有意な差を示した3番目の小さなクラスのパラメーターを特定しましたが（図2、追加ファイル3、図S2d、hを参照）、予期せぬことに、いずれかのセンターで反対の傾向が見られました。これらの異常の理由について説明します。これらの異常は、おそらく遺伝子と中心の相互作用から生じる場合があります。最後のクラスは、センター間で一貫した有意な違いが観察されなかった多数のテストを表しており、これらはN / Jの違いの証拠ではなく、誤検出である可能性が高いと結論付けています（追加ファイル3、図S2cを参照） 、g）。

形態異常と眼科

骨格のX線分析を含め、NとJの形態的特徴に大きな違いがあるという証拠は見つかりませんでした。ただし、2つの菌株間の眼科の違いの数が識別されました。仮想視運動ドラムを使用した一般的な視覚機能の分析では、Jマウスと比較してNの視力が低下していることがわかりました（N：0.314サイクル/度、95％CI 0.305〜0.323、n = 89; J：0.399サイクル/度、95％CI 0.394 〜0.404、n = 128; p < 0.001、スチューデントのt検定）。Scheimpflugカメラを使用した定量分析で透明レンズが検出されたため、これはレンズの不透明度の違いを反映していませんでした。両方の系統（N：5.2 + 0.5％、n = 10; J：5.0％+ 0.5％不透明度、n = 10）。Nマウスの眼底に白い斑点が高頻度で見られましたが、Jマウスには見られませんでした（図3A）これはおそらく以前に報告されたようにNマウスのCrb1rd8mutationの存在によるものですが、私たちの場合、斑点は腹側網膜にのみ見られ、斑点のサイズとマウス間の影響領域にばらつきがありました（図3A）局所眼底内視鏡検査を使用したさらなる研究は、主要な血管の数が可変であり、静脈の場合は3〜7、3およびeigの範囲であることが示された。動脈の場合はht（図3B）であり、特定のマウスの2つの目の間の数が一致しない可能性があります。静脈と動脈の両方の平均数は、NマウスよりもJの方が有意に高かった（P < 0.001）（図3C）。

心臓血管

非侵襲的血圧測定（ESLIM_002）は、収縮期動脈圧がNマウスよりもJで有意に高いことを示しましたが、効果の有意性は性別間およびセンター間で変動することがわかりました。さらに、すべてのセンターは、脈拍数がJマウスよりもNで有意に高いことを観察しました。しかし、コンソーシアム内の二次パートナーは、麻酔下の心拍数がJ雄マウスよりもNで有意に低く、長い心拍間（RR）とQTc間隔に反映されていることを発見しました。また、脛骨の長さに正規化された心臓の重量（ESLIM_020）は、2つのセンターのJマウスよりもNで有意に低いことがわかり、これらの結果は二次分析によって個別に確認されました。心エコー検査による心臓の構造と機能、および血行動態による心臓収縮機能のさらなる研究では、NとJの違いを明らかにすることはできませんでした（データは示していません）。

代謝

間接熱量測定の場合自由給餌マウス（ESLIM_003）の場合、O2消費、CO2生成、および熱生成に関して、NとJの間に一貫した違いがあることがわかりました。 Jマウスは、一般的に女性でより顕著であったNと比較して、ガス交換の減少とエネルギー消費（熱産生または代謝率）の低下を示しました。絶食間接熱量測定による二次表現型検査では、夜間のJ対Nのエネルギー消費量が少なくなる傾向がありました。これは、特に再給餌の際に、夜間のNと比較してJの歩行活動の低下とJの食物摂取量の低下に関連している可能性があります（データは示していません）。活動が測定された2つのセンターでは、自由給餌熱量測定画面（ESLIM_003）で活動に一貫した違いはありませんでした（追加ファイル3、図S2c、gを参照）。単純化された腹腔内ブドウ糖負荷試験（IPGTT）（ESLIM_004）は、JマウスとNマウスの耐糖能障害を示しました。糖代謝に関するこれらの観察結果は、Jマウスに特異的なNnt遺伝子の既知の欠失と一致しており、膵臓ベータ細胞のインスリン反応の調節に役割を果たすことが示されています。

二重エネルギーX線吸収測定法-光線吸収測定法（DEXA）の体組成と骨密度測定（ESLIM_005）は、N個のマウスの脂肪量が増加していることを示しました（絶対および重量に対して正規化）。さらに、DEXA測定は、JマウスがNと比較して除脂肪量が増加していることを示しました。2つのセンターでは、骨塩密度測定値はJ雄マウスの方が高かった。ただし、この発見は、DEXAスクリーニングを実施した3番目のセンターでは再現されませんでした。 2つの菌株のマイクロコンピューター断層撮影（μCT）分析を実施し（図4）、皮質の厚さ、皮質の多孔性、および小柱の骨量がNとJの間で変化しないことを発見しました。さらに、さまざまなマイクロアーキテクチャの分析パラメータは、全体的な小柱網が類似していることを示しました。最後に、骨形成および吸収マーカーの測定では、2つの株の違いを明らかにすることができませんでした（図4）。

神経学的、行動的、感覚的

2つのセンターオープンフィールド（ESLIM_007）（図2）での活動において、NとJの間に大きな一貫した違いが見られました。これには、移動距離で測定したJマウスの活動の増加や、不安の軽減を示すセンターエントリーの数の増加が含まれます。これらの違いは、NとJの行動比較について最近報告されたデータと一致しています。興味深いことに、最も重要な影響は2つのセンターの男性に限定されていました。予期せぬことに、第3のセンターでは、逆のことが見られ、N匹のマウスがJよりも活動的でしたが、これらの効果はオスとメスの両方で見られました。 4番目のセンターはこれらの影響を検出せず、有意差は見つかりませんでした。センターはすべて、同様のサイズのアリーナの要件を含む手順にEMPReSSslim SOPを使用しましたが、アリーナを収容するための単一または複数の部屋の使用など、センター間にいくつかの運用上の違いがありました。透明面または不透明面のアリーナ。そして、ホームケージ内の環境強化の有無（行動の結果に影響を与えることが知られています）。ただし、これらの変数はいずれも、センター間の観測値の違いと一致していませんでした。ただし、センター間で異なると予想される腸内細菌叢の影響を排除することはできません。腸内細菌叢は、主に視床下部-下垂体-副腎軸を介して中枢神経系の機能と行動に影響を与えることが知られています。特定の条件下では、NとJの間のオープンフィールドパラメータに大きな違いが見られると結論付けていますが、これらの違いの性質は未知の環境条件に敏感です。 N対J表現型の主な矛盾した発見が、行動表現型プラットフォームに限定されていたのは興味深いことです。対照的に、他のほとんどのテスト（いくつかの血液学的および臨床化学パラメータを除いて、以下を参照）では、矛盾は見つかりませんでした。これは、ほとんどの表現型プラットフォームとは対照的に、行動分析が環境パラメータに非常に敏感であることを示しています。

N株とJ株の不安を比較するために、明暗遷移テストも実施しました（図5）。明暗遷移の数または暗いコンパートメントで費やされた時間の割合に、NマウスとJマウスの間に有意差は見つかりませんでした。ただし、暗いコンパートメントに入るまでの待ち時間は、Nマウスで有意に高かった。 4つのセンターすべてでの修正SHIRPA（SmithKline Beecham、Harwell、Imperial College、Royal London Hospital、表現型評価）テスト（ESLIM_008、図1a）は、オスのJマウスの運動活動が有意に増加したことを示しました。一部のセンターでのオープンフィールドテスト（上記を参照）。

運動能力を反映するいくつかのテストを実施しました。握力の違い（ESLIM_009）は、JがNよりも高いすべてのセンターで見られましたが、影響を受けるパラメーターは異なり、一部のセンターでは前肢の握力の違いが報告され、一部のセンターでは前肢と後肢の握力の組み合わせが報告されました（図1a 、b）。ロータロッドテスト（ESLIM_010）は、すべてのセンターで潜時の有意差を示しましたが、Nの運動能力の低下は、2つのセンターの女性でのみ見られました。さらに、ロータロッドでの4日間の運動学習パフォーマンスを調べることにより、NおよびJオスマウスの運動能力を調査しました（図5）。 Jマウスの運動能力は1日目から2日目まで著しく改善しましたが、Nマウスの能力は徐々にしか改善せず、3日目からのみ1日目の測定値と有意に異なりました（P < 0.05）以降。さらに、2日目から4日目まで、NとJの間で落下するまでの待ち時間に非常に有意な差がありました。したがって、センターで実施された一次テストでは、Nの潜在的な運動能力の低下が明らかになり、より高度なテストによって確認され、さらに詳しく説明されました。

また、NとJの違いをさらに詳しく説明するために、2つの追加の行動テストを実行しました。まず、空間記憶を評価するために使用されるモリス水迷路テストでNとJのパフォーマンスを比較しました。 N匹のオスのマウスは、J匹のオスのマウスと比較して非常に有意に低下したパフォーマンス（より高い潜時）を示しました（図6）。次に、手がかりと文脈的恐怖条件付けテストを使用して、嫌悪イベントの感情的学習または記憶を調べました。ただし、ここでは2つの株の間に有意差は見られませんでした（データは示していません）。

2つの株での音響驚愕とプレパルス抑制（ESLIM_011）（図1a）の調査により、さまざまなパラメーターが特定されました。これは、センター間で大幅かつ一貫して異なっていました。 110 dBでの音響驚愕の大きさ、およびプレパルスとパルス（PP1-PP4 +パルス、EMPReSSslimを参照）に対する驚愕反応の大きさは、Jと比較してNで減少しましたが、この効果は1つのセンターの女性では見られませんでした。これらの観察結果と一致して、プレパルス抑制はNとJの間で異なり、PP2とPP3でのプレパルス抑制と、Jと比較してNでグローバル抑制が増加することがわかりました。他のいくつかの驚愕の大きさとプレパルス抑制パラメーターは、 1つまたは2つのセンター（図1b;追加ファイル3、図S2b、fを参照）が、他のセンターでは違いは見られませんでした。聴性脳幹反応テストを使用してJマウスとNマウスの両方で聴覚閾値を評価し、違いが見つからなかったため、驚異的な大きさの観察結果は聴覚の違いによって混乱しませんでした（データは示していません）。

臨床化学

臨床化学試験の広範なパネルが、各表現型パイプラインの最後に収集された血漿サンプルで実行されました。パイプライン1の終わりの血液サンプル（ESLIM_021）は一晩絶食した後に収集されましたが、パイプライン2の終わりのサンプル（ESLIM_015）は自由給餌の動物からのものでした。少なくとも3つのセンターからのデータは、尿素と電解質のナトリウム、カリウム、および塩化物が、Nマウスと比較してJマウスの血漿で有意に高かったことを示しました（図1a）。自由給餌および絶食時の血漿グルコースレベルのデータは、各試験について、少なくとも2つのセンターがJマウスよりもNの方が血漿グルコースレベルが高いことを発見したことを示しました（図1b）。ただし、血糖値は、動物の取り扱い、サンプル処理、および麻酔薬の使用によって影響を受けることが知られています。ここに示されているデータは、ケタミン/キシラジン注射でサンプルが収集された1つのセンターを除いて、すべてガス状イソフルラン麻酔薬で収集されたサンプルからのものです（図1を参照）。上記のように、インスリン分泌の既知の障害のため、Jマウスの血漿グルコースレベルがNマウスよりも低いことは矛盾しているようですが、Nntの削除は、グルコースクリアランス率のみに影響し、絶食または非チャレンジJマウスに影響を与えるようです。一定の高血糖はありません。他のいくつかのパラメーターは、少なくとも2つのセンターでNマウスよりもJで高いことが示されましたが、いずれの場合も、他のセンターは同じパラメーター（図1b）で有意差を報告しませんでした（図1b）。たとえば、遊離脂肪酸。 2つのセンターは、鉄がN人の男性で有意に高く、アルカリホスファターゼがJ人の男性で有意に高かったことを発見しました。これらのセンターの1つは、女性にも同じことが当てはまることがわかりました（図2）。ただし、第3のセンターからのこれらの各パラメーターのデータは、これらの調査結果と矛盾します。

血液学

パイプライン2（ESLIM_016）の最後に、さまざまな血液学的パラメーターが測定されました。 2つのセンターで多くのパラメーターに有意な変化が見られましたが、これらの結果は、白血球数と赤血球数、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビンなど、他のセンターでは再現されませんでした（図1b）。ヘマトクリット値と平均赤血球ヘモグロビン濃度のテストでは、矛盾する結果が得られました（図2）。いずれの場合も、2つのセンターからのデータは一致しましたが、3番目のセンターは反対の効果を示しました。これは、メタデータに記録されているように、参加クリニックで血液学的測定に使用されたさまざまな機械技術が原因である可能性があります。

免疫機能とアレルギー

いくつかの二次表現型を調査しましたJおよびN株のリステリア菌に対する宿主の耐性を含む。両方の菌株の雌は、リステリア・モノサイトゲネス感染に対してより感受性が高かった。ただし、リステリア菌の宿主感受性の性差は、JよりもNの方が顕著ではありませんでした。N株の雄は、Jの雄と比較して感染後4日目にリステリアのクリアランスの増強を示しました。これは、J男性と比較して感染後3日目のN男性の炎症誘発性反応の増加と相関しています（図7）。

NマウスとJマウスのテストも行いました。ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）誘発性接触過敏症（CHS）。 CHS応答の有意差は、マウスの2つの系統間で識別され、JはCHS応答の増加を示しています。注目すべきことに、両方の系統の雌マウスは、雄マウスと比較して増加したCHSを示した。ナチュラルキラー（NK）細胞のさまざまな刺激に対する応答性の調査では、Nマウスと比較して、Jにおいてインターロイキン（IL）-12単独またはIL-2との組み合わせによってNK細胞の大部分が活性化されることが示されました。繰り返しますが、この反応は女性でより顕著でした（図8）。