p53経路：正および負のフィードバックループ

文献のさまざまな研究により、p53経路に10個の正または負のフィードバックループが特定されています（図3、4、5、6を参照）。 7、8、9および10）。これらのループのそれぞれは、その活性または合成速度がp53の活性化によって影響を受けるタンパク質で構成される回路を作成し、これにより、細胞内のp53活性が変化します。これらのうち、7つはp53活性を調節する負のフィードバックループ（MDM-2、Cop-1、Pirh-2、p73デルタN、サイクリンG、Wip-1、Siah-1）であり、3つは正のフィードバックループ（PTEN- p53活性を調節するAKT、p14 / 19 ARFおよびRb）。これらのネットワークまたは回路はすべて、転写レベルでのp53活性によって誘導されるか、p53によって転写抑制されるか（p14 / 19 ARF、図3）、p53誘導タンパク質によって制御されるという点で自己調節性です。これらのフィードバックループのうち6つは、MDM-2（MDM-2、サイクリンG、Siah-1、p14 / 19 ARF、AKT、およびRb）を介して作用し、p53活性を調節します。

エキサイティングな発見は、p53経路が他のシグナル伝達と密接に関連していることです。癌の起源に重要な役割を果たす経路。調査された最初の接続の1つには、p14 / p19ARFとMDM-2が含まれます。 p14 / 19 ARFタンパク質はMDM-2タンパク質に結合し、そのユビキチンリガーゼ活性を調節して、p53タンパク質のレベルを上昇させます（Honda and Yasuda、1999）（図3）。 p14 / 19 ARF遺伝子の転写は、E2F-1（Zhu et al。、1999）およびベータカテニン（Damalas et al。、2001）によって正に調節され、p53自体によって負に調節されます。さらに、p14 / 19 ARFタンパク質のレベルは、細胞内のRasおよびMyc活性によって増加します（図3）。 p14 / p19 ARFによるp53の調節の複雑さは、最近見直されました（Lowe and Sherr、2003）。 p14 / 19 ARF-MDM-2複合体は、p14 / p19 ARF内に存在する核小体局在化シグナルのために、細胞の核小体に局在化することがよくあります。核小体はリボソーム生合成の部位であり、p14 / 19 ARF活性自体が、リボソームRNA前駆体の成熟リボソームサブユニットへのRNAプロセシングの速度を変える可能性があります（Sugimoto et al。、2003）。したがって、MDM-2およびp53レベルを制御し、これをリボソーム生合成と調整することによるp14 / 19 ARFは、細胞周期の調節において重要な役割を果たします。これは最近、p14 / 19 ARFタンパク質がMyc活性（したがって細胞サイズ）も調節できるという実証によって強化されました（Datta et al。、2004）。ただし、核小体のMDM-2は受動的なエンティティではありません。 MDM-2タンパク質は、3つの大きなリボソームサブユニットタンパク質L5、L11、およびL23に特異的に結合することが示されています（Marechal et al。、1994; Lohrum et al。、2003; Zhang et al。、2003; Dai et al。、2004 ）、およびL5（Dai and Lu、2004）またはL11（Lohrum et al。、2003; Zhang et al。、2003）のMDM-2への結合は、そのユビキチンリガーゼ活性を低下させます。さらに、MDM-2のリングフィンガードメインは、大きなリボソームRNAサブユニットに見られるRNA配列に特異的に結合します（Elenbaas et al。、1996）。これらの観察結果はすべて、リボソーム生合成と細胞周期の調節におけるMDM-2とp14 / 19 ARFの中心的な役割を示していますが、これらの観察結果がどのように組み合わされてこの調節ループを形成するかはわかりません。

Rbタンパク質は、MDM-2およびp53との複合体の細胞に見られ、高いp53活性とアポトーシス活性の増強をもたらします（Xiao et al。、1995）。 Rbに結合していない高レベルの活性E2F-1は、p53応答をG-1停止からアポトーシスに切り替えます。 RbとMDM-2の両方がリン酸化され、サイクリンE-cdk2によって阻害されます（図4）。 p53が活性化されると、サイクリンE-cdk2活性を阻害するp21タンパク質の合成が刺激され、これがRb-MDM-2複合体に作用してp53活性とアポトーシスを促進します。 DNA損傷後、MDM-2タンパク質とp53タンパク質の両方がATMタンパク質キナーゼによって修飾されます（図4）。これは、p53-MDM-2-Rb複合体がp53機能を増加させ、アポトーシス促進性であるのと同じ方法で、p53活性を増強します。 p53-Rb-E2F1軸の最近の詳細なレビューについては、Yamasaki（2003）を参照してください。

p53タンパク質の活性化の一部には、残基33および46にあるセリンでのp53タンパク質のリン酸化が含まれます。 p38 MAPキナーゼ（図5）。このp38MAPキナーゼは、Wip-1ホスファターゼによって逆転または不活性化されるリン酸化（Ras-Raf-Mek-Erk経路によって調節される）によってそれ自体が活性化されます。 Wip-1は、負の自己調節ループを形成し、p53とRas経路を接続するp53応答性またはp53調節遺伝子です（Takekawa et al。、2000）（図5）。活性化されたp53タンパク質は、ユビキチンリガーゼSiah-1の転写を正に調節し（Fiucci et al。、2004）、それが次にベータカテニンタンパク質を分解するように作用します（Iwai et al。、2004）（図6）。ベータカテニンレベルはp14 / 19 ARF遺伝子を調節することができ、それがMDM-2を負に調節し、より高いp53レベル（正のフィードバックループ）をもたらします（図6）。したがって、Siah-1はWnt-beta-catenin-APC経路をp53経路に接続します。一部の細胞タイプでは、p53タンパク質がPTEN遺伝子の転写を誘導します（図7）。 PTENタンパク質はPIP-3ホスファターゼです。 PIP-3は、MDM-2タンパク質を含む多くの抗アポトーシスタンパク質基質を持つAKTキナーゼを活性化します。リン酸化により、MDM-2が核に移行し、そこでp53が不活性化されます（図7）。これにより、p53経路がIGF-1-AKT経路に接続され、p53活性の増強とAKT活性の低下に対する正のフィードバックループが形成されます。 p53調節におけるこのループも最近見直されました（Gottlieb et al。、2002）。これらの正と負のフィードバックループは2つのことを達成します：（1）それらは細胞内のp53活性を調節し、（2）それらは細胞周期への細胞の侵入を調節する他のシグナル伝達経路（Rb-E2F-1）とp53活性を調整しますmyc、Ras、ベータカテニン、IGF-1、およびサイクリンE-cdk2の活性。

p53機能に負のフィードバックを与える2つの追加のp53自動調節回路があります。 p53応答性遺伝子の中で最も活性の高いものの1つはサイクリンG遺伝子です。多種多様な細胞タイプでp53が活性化された後、急速に高レベルに転写されます（Okamoto and Beach、1994; Zauberman et al。、1995; Bates et al。、1996; Yardley et al。、1998）。サイクリンGタンパク質はPP2Aホスファターゼと複合体を形成し、MDM-2からリン酸残基を除去し（Okamoto et al。、2002）（図8）、cdkキナーゼによってMDM-2タンパク質に付加されます（Zhang and Prives、2001）（図4）。サイクリンA / cdk2によるMDM-2のリン酸化はその活性を阻害するため、サイクリンG-PP2AホスファターゼはMDM-2活性を増強し、p53を阻害します。サイクリンG遺伝子がノックアウトされたマウスは生存可能であり（Kimura et al。、2001）、サイクリンGヌルマウス胚線維芽細胞はストレスがない場合にp53タンパク質レベルが上昇しており（Okamoto et al。、2002）、このフィードバックループがインビボで機能し、ストレス後のより高いp53活性化レベルだけでなく、細胞内のp53の基礎レベルに作用します。 2番目の負のフィードバックループには、構造と機能によって関連し、共通の前駆体から進化したp53、p63、およびp73を含む転写因子のp53ファミリーのメンバーが含まれます。ストレス反応の後、p53遺伝子が活性化され、p73デルタNと呼ばれるp73遺伝子からの特定のスプライシングされたm-RNAの転写が刺激されます（図9）。これは、アミノ末端ドメインなしでp73タンパク質を翻訳します。タンパク質のp53ファミリーの3つすべては、上記の特定のDNA配列に結合する中央コアドメインにリンクされたN末端転写活性化ドメインで構成される同様のドメイン構造を持っています。 p53、p63、およびp73は異なる転写プログラムを開始することができますが、3つのp53ファミリー転写因子はすべて同じDNA配列を認識します。しかし、Harms et al。で最近レビューされたように、3つのタンパク質すべてによって調節できる共通の遺伝子が多数あります。 （2004）。したがって、p53がp73デルタNの転写を活性化すると、p73デルタNタンパク質はp53調節遺伝子の多くに結合できますが、トランス活性化ドメインがないため、p53転写活性化のリプレッサーまたは競合物質として機能します。このようにして、負のフィードバックループが設定され、p53活性が低下します（Grob et al。、2001; Kartasheva et al。、2002）（図9）。したがって、これらの正または負のフィードバック回路のうち5つ（Rb、PTEN、Siah-1、Wip-1、p14 / 19 ARF）は、他のシグナル伝達経路の中心メンバーである遺伝子とタンパク質を含み、2つ（サイクリンGとp73デルタ）はN）直接的な負のフィードバックループを形成します。

ここで説明する最後の負のフィードバックループは、ユビキチンリガーゼの形で提供されます。驚いたことに、3つの異なるp53-ユビキチンリガーゼ活性（MDM-2、Cop-1、Pirh-1）があり、それぞれが自己調節ループを形成して、p53活性を低下させているようです（Leng et al。、2003; Dornan et al。 。、2004）（図10）。各遺伝子はp53によって転写的に活性化されます。このレベルの冗長性がある理由は、現時点では不明です。いくつかの可能性は、これらの遺伝子産物が異なる細胞または組織タイプで、あるいは異なる発達段階でさえも最適に発現または作用することです。たとえば、MDM-2ノックアウトマウスは、胚盤胞の着床直後の受精後約6日で致死的です。これは、その段階で発生しなければならない低酸素症によって引き起こされる可能性があり、MDM-2の非存在下でp53を活性化し、アポトーシスを引き起こします。この解釈と一致しているのは、p53、MDM-2ダブルノックアウトマウスが生存可能であり、p53ノックアウトマウスと同じように正常に生まれるという観察です（Jones et al。、1995; Montes de Oca Luna et al。、1995）。したがって、これは、MDM-2タンパク質が胚盤胞段階でバックアップユビキチンリガーゼ活性なしで作用するという考えと一致していますが、これらの他のタンパク質は、発達の後の段階でより正常な機能を可能にする可能性があります。これらのアイデアは現在テスト可能です。これら3つのユビキチンリガーゼの1つまたは複数が、ストレスのない状態または基底状態でのp53レベルの維持に関与している一方で、他のリガーゼはストレスによって誘発されたp53が生成された後にのみ作用する可能性もあります。活性化されたp53とストレスによって誘発されたp53タンパク質は非常に異なるタンパク質修飾を持っており、MDM-2、Cop-1、またはPirh-2の活性に対するこれの影響は現在不明です。これらの3つのユビキチンリガーゼのそれぞれが細胞内でタンパク質複合体を形成し、関連するタンパク質がこれらのリガーゼのそれぞれで大きく異なり、それらを異なる調節回路に接続している可能性があります。現在、MDM-2については多くのことが知られており、過去1年ほどの文献でのみ報告されているCop-1とPirh-2の役割にはあまり焦点が当てられていません。さらに、ごく最近、p53がさらに別のE3ユビキチンリガーゼ酵素であるトッパーの基質であることが示されました（Rajendra et al。、2004）。トッパーがp53の転写標的でもあるかどうかはまだ決定されていないため、p53経路の自己調節制御に寄与するタンパク質のリストに追加する必要があります。今後数年間の研究でこれらの質問に対処する必要があります。

前述のように、規制ループの多くはMDM-2に関係しているため、p53活性の制御におけるMDM-2の中心的な役割が強調されています。このタンパク質複合体をブロックするp53およびMDM-2変異の遺伝子分析により、この結合相互作用に重要な各タンパク質の重要なアミノ酸残基が特定されました（Lin et al。、1994; Freedman et al。、1997）。これらの同じアミノ酸残基は、HDM-2（ヒトタンパク質）のアミノ末端とp53のアミノ末端からのペプチドの結晶構造においてこれらのタンパク質接触を行うことが示されています（Kussie et al。、1996） 。 p53の残基であるフェニルアラニン19、トリプトファン23、およびロイシン26は、MDM-2疎水性ポケットの主要な接触を形成します。残基セリン20およびおそらくセリン15のリン酸化はこれらの接触を弱めるはずであり、これらの接触と競合するペプチドおよび薬物はp53 MDM-2複合体をブロックし、細胞のアポトーシスを促進します（Klein and Vassilev、2004）。したがって、p53-MDM-2複合体とMDM-2ユビキチンリガーゼ活性は、一部の癌の主要な創薬ターゲットになっています。ヒト肉腫の約3分の1、および一部の白血病と神経膠芽腫では、HDM-2遺伝子が増幅されており、このタンパク質が過剰発現しています。 p53遺伝子は野生型であり、p53タンパク質は明らかに不活性であるため、p53-HDM-2複合体を破壊する薬剤はp53を活性化するはずです。さらに、他の多くの癌は、HDM-2遺伝子が増幅されていない場合でも、HDM-2遺伝子産物を高レベルで発現しているようです。これらのタイプの癌では、HDM-2活性をブロックするか、この複合体からp53を解放することで、癌細胞にアポトーシスを選択的に誘導することができます。これはまた、p53を活性化するいくつかの薬剤の化学療法活性を高める可能性があります。

p53-MDM-2自動調節ループは、p53およびMDM-2レベルが時間とともに増減し、セル内で位相がずれた発振器をセットアップすると予測されています。これは、p53ストレス応答を受けている培養細胞からのタンパク質のウエスタンブロットを使用してMDM-2およびp53レベルを測定することによって最初に実証されました（Lev Bar-Or et al。、2000）。振動が観察され、時間とともに減衰しますが、この実験では、振動の位相がずれている可能性のある培養中の多くの細胞からのタンパク質濃度を平均し、建設的または破壊的な干渉を引き起こします。このため、蛍光標識されたp53およびHDM2融合タンパク質を個々の細胞で画像化し、p53ストレス応答を受けている細胞のp53およびHDM-2レベルの変化を追跡しました。予想される位相のずれた振動が観察され、驚くべきことに、セル内の振動の数は、これらのセルに与えられた放射線の線量に比例していました（Lahav et al。、2004）。これは、p53がストレス信号の強度をアナログ方式（より高いp53濃度）ではなくデジタル方式（振動数）で測定する可能性があることを示唆しています。同様の振動は、NF-κ-BおよびI-κ-Bタンパク質を伴うNF-κ-B経路などの負の自己調節ループを持つ他のシグナル伝達経路でも観察されています（Scott et al。、1993）。転写因子の量の振動から生じるこれらのデジタル信号は、周期的な遺伝子発現のパターンをもたらす可能性があります。しかし、転写因子レベルのデジタル信号が、遺伝子によって生成されるmRNAの量のレベルでアナログ信号にどのように翻訳されるかは不明なままです。これらの実験は、異なる数の振動、振動のタイミングまたは波長、またはこれらの振動の振幅が、選択された遺伝子発現パターンおよびp53の結果（細胞周期停止、アポトーシスまたは老化）に影響を与える可能性につながります。応答。

p53経路に非常に多くのフィードバックループがあるのはなぜですか？この質問には多くの答えがあります。すべてのメカニズムが、同じ細胞または組織タイプで、または発生中の同じ段階でアクティブであるとは限りません。ここで説明するタイプのフィードバックループは、p53経路を他のシグナル伝達経路に接続し、成長と分裂のために細胞シグナルを調整する手段を提供します。システムの冗長性はエラーを防ぐことができ、バックアップシステムは突然変異の表現型を減らします。一方、図3、4、5、6、7、8、9、および10に示されているフィードバックループのすべてが、時間のテストとさらなる実験に耐えられるとは限りません。これらの経路の多くは、これらの経路を変更する変異を持つ培養中の癌細胞で実施された実験によって解明されています。培養またはノックアウトマウスの正常細胞でさえ（突然変異への適応のため）、invivoで正常細胞および器官で発生するすべての状態を反映していない可能性があります。特定のプロテインキナーゼまたはホスファターゼがインビボで特定の基質に作用し、定量的に測定できる結果をもたらすことを証明することは特に困難です。したがって、私たちは細胞内で機能すると信じている機能と経路をテストし、挑戦し続ける必要があります。ただし、図3、4、5、6、7、8、9、および10に示すこれらの構成は、仮説を立て、アイデアをテストするのに役立ちます。これにより、癌の性質と薬剤の設計に関する新たな洞察が確実に得られます。がん細胞を選択的に殺す薬剤。