p53 경로 : 양성 및 음성 피드백 루프

문헌의 다양한 연구에서 p53 경로에서 10 개의 양성 또는 음성 피드백 루프가 확인되었습니다 (그림 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10). 이러한 각 루프는 활성 또는 합성 속도가 p53의 활성화에 의해 영향을받는 단백질로 구성된 회로를 생성하며, 이는 차례로 세포에서 p53 활성의 변화를 초래합니다. 이 중 7 개는 p53 활동 (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyclin G, Wip-1 및 Siah-1)을 조절하는 부정적인 피드백 루프이고 3 개는 긍정적 인 피드백 루프 (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF 및 Rb)는 p53 활성을 조절합니다. 이러한 모든 네트워크 또는 회로는 전사 수준에서 p53 활성에 의해 유도되거나, p53에 의해 전사적으로 억제되거나 (p14 / 19 ARF, 그림 3), p53 유도 단백질에 의해 조절된다는 점에서 자동 조절됩니다. 이러한 피드백 루프 중 6 개는 MDM-2 (MDM-2, cyclin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT 및 Rb)를 통해 작동하여 p53 활동을 조절합니다.

흥미로운 발견은 p53 경로가 다른 신호 전달과 밀접하게 연결되어 있다는 것입니다. 암의 기원에 중요한 역할을하는 경로. 연구 된 첫 번째 연결 중 하나는 p14 / p19ARF 및 MDM-2입니다. p14 / 19 ARF 단백질은 MDM-2 단백질에 결합하고 유비퀴틴 리가 제 활성을 조절하여 p53 단백질 수준을 증가시킵니다 (Honda and Yasuda, 1999) (그림 3). p14 / 19 ARF 유전자의 전사는 E2F-1 (Zhu et al., 1999) 및 베타-카테닌 (Damalas et al., 2001)에 의해 양성으로 조절되고 p53 자체에 의해 음성 조절됩니다. 또한 p14 / 19 ARF 단백질의 수준은 세포에서 Ras 및 Myc 활동에 의해 증가합니다 (그림 3). p14 / p19 ARF에 의한 p53 규제의 복잡성이 최근 검토되었습니다 (Lowe and Sherr, 2003). p14 / 19 ARF-MDM-2 복합체는 종종 p14 / p19 ARF 내에 존재하는 핵 위치 신호로 인해 세포의 핵소체에 위치합니다. 핵소체는 리보솜 생 생성 부위이며 p14 / 19 ARF 활성 자체는 리보솜 RNA 전구체의 RNA 처리 속도를 성숙한 리보솜 서브 유닛으로 변경할 수 있습니다 (Sugimoto et al., 2003). 따라서 MDM-2 및 p53 수준을 제어하고이를 리보솜 생생 성과 조정함으로써 p14 / 19 ARF는 세포주기 조절에 중요한 역할을합니다. 이것은 최근에 p14 / 19 ARF 단백질이 Myc 활성 (따라서 세포 크기)도 조절할 수 있다는 증거로 강화되었습니다 (Datta et al., 2004). 그러나 핵소체의 MDM-2는 수동적 독립 체가 아닙니다. MDM-2 단백질은 3 개의 큰 리보솜 서브 유닛 단백질 L5, L11 및 L23에 특이 적으로 결합하는 것으로 나타났습니다 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), L5 (Dai and Lu, 2004) 또는 L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003)이 MDM-2에 결합하면 유비퀴틴 리가 아제 활성이 낮아집니다. 또한 MDM-2의 고리-손가락 도메인은 큰 리보솜 RNA 서브 유닛에서 발견되는 RNA 서열에 특이 적으로 결합합니다 (Elenbaas et al., 1996). 이러한 모든 관찰이 MDM-2 및 p14 / 19 ARF의 리보솜 생 생성 및 세포주기 조절에 대한 중심 역할을 가리 키지 만, 이러한 관찰이 어떻게 결합하여이 조절 루프를 형성하는지 이해하지 못합니다.

Rb 단백질은 MDM-2 및 p53과의 복합체에서 세포에서 발견 될 수 있으며, 결과적으로 높은 p53 활성과 향상된 세포 자멸 활성을 나타냅니다 (Xiao et al., 1995). Rb에 결합되지 않은 높은 수준의 활성 E2F-1은 p53 반응을 G-1 정지에서 아폽토시스로 전환합니다. Rb와 MDM-2는 모두 cyclin E-cdk2에 의해 인산화되고 억제됩니다 (그림 4). p53이 활성화되면 cyclin E-cdk2 활성을 억제하는 p21 단백질의 합성을 자극하고, 이는 차례로 p53 활성과 세포 사멸을 촉진하는 Rb-MDM-2 복합체에 작용합니다. DNA 손상 후 MDM-2 단백질과 p53 단백질은 모두 ATM 단백질 키나아제에 의해 변형됩니다 (그림 4). 이것은 p53-MDM-2-Rb 복합체가 p53 기능을 증가시키고 proapoptotic 인 것과 같은 방식으로 p53 활성을 향상시킵니다. p53-Rb-E2F1 축에 대한 자세한 최근 검토는 Yamasaki (2003)를 참조하십시오.

p53 단백질 활성화의 일부는 잔기 33 및 46에 위치한 세린에서 p53 단백질의 인산화를 포함합니다. p38 MAP 키나아제 (그림 5). 이 p38 MAP 키나제는 Wip-1 포스파타제에 의해 역전되거나 비활성화 될 수있는 인산화 (Ras-Raf-Mek-Erk 경로에 의해 조절됨)에 의해 자체적으로 활성화됩니다. Wip-1은 p53 반응성 또는 p53 조절 유전자로 음성자가 조절 루프를 형성하고 p53 및 Ras 경로를 연결합니다 (Takekawa et al., 2000) (그림 5). 활성화 된 p53 단백질은 유비퀴틴 리가 아제 Siah-1 (Fiucci et al., 2004)의 전사를 긍정적으로 조절하며, 이는 차례로 베타-카테닌 단백질을 분해하는 역할을합니다 (Iwai et al., 2004) (그림 6). 베타-카테닌 수준은 p14 / 19 ARF 유전자를 조절할 수 있으며, 이는 차례로 MDM-2를 부정적으로 조절하고 더 높은 p53 수준을 초래합니다 (양성 피드백 루프) (그림 6). 따라서 Siah-1은 Wnt- 베타-카테닌 -APC 경로를 p53 경로에 연결합니다. 일부 세포 유형에서 p53 단백질은 PTEN 유전자의 전사를 유도합니다 (그림 7). PTEN 단백질은 PIP-3 포스파타제입니다. PIP-3는 MDM-2 단백질을 포함하여 많은 항 세포 자멸 단백질 기질을 가진 AKT 키나아제를 활성화합니다. 인산화는 MDM-2가 p53을 비활성화시키는 핵으로의 전위를 초래합니다 (그림 7). 이것은 p53 경로를 IGF-1-AKT 경로와 연결하고 향상된 p53 활성 및 감소 된 AKT 활성에 대한 양성 피드백 루프를 형성합니다. p53 규정의이 루프도 최근 검토되었습니다 (Gottlieb et al., 2002). 이러한 양성 및 음성 피드백 루프는 (1) 세포에서 p53 활동을 조절하고 (2) p53 활동을 세포 주기로의 세포 진입을 조절하는 다른 신호 전달 경로 (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenin, IGF-1 및 cyclin E-cdk2 활동).

p53 기능에 부정적인 피드백을주는 두 개의 추가 p53 자동 조절 회로가 있습니다. p53 반응성 유전자 중 가장 활동적인 유전자 중 하나는 cyclin G 유전자입니다. 다양한 세포 유형에서 p53 활성화 후 빠르게 높은 수준으로 전사된다 (Okamoto and Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). cyclin G 단백질은 MDM-2 (Okamoto et al., 2002)에서 인산 잔기를 제거하는 PP2A 포스파타제와 복합체를 형성합니다 (그림 8). 이는 cdk 키나제 (Zhang 및 Zhang)에 의해 MDM-2 단백질에 추가됩니다. Prives, 2001) (그림 4). cyclin A / cdk2에 의한 MDM-2의 인산화는 그 활성을 억제하므로, cyclin G-PP2A 포스파타제는 MDM-2 활성을 향상시키고 p53을 억제합니다. cyclin G 유전자가 녹아웃 된 마우스는 생존 가능하며 (Kimura et al., 2001), cyclin G null 마우스 배아 섬유 아세포는 스트레스가 없을 때 p53 단백질 수준이 상승하여 (Okamoto et al., 2002) 이러한 피드백 루프가 있음을 보여줍니다. 생체 내에서 작동하며 스트레스 후 더 높은 p53 활성화 수준뿐만 아니라 세포에서 p53의 기본 수준에 작용합니다. 두 번째 네거티브 피드백 루프는 구조 및 기능에 의해 관련되고 공통 전구체에서 진화 한 p53, p63 및 p73을 포함하는 전사 인자의 p53 패밀리의 구성원을 포함합니다. 스트레스 반응 후 p53 유전자가 활성화되어 p73 유전자에서 특정 스 플라이 싱 된 m-RNA의 전사를 자극합니다 (p73 delta N이라고 함) (그림 9). 이것은 아미노 말단 도메인이없는 p73 단백질을 번역합니다. 3 개의 p53 계열 단백질 모두는 위에서 논의 된 특정 DNA 서열에 결합하는 중앙 코어 도메인에 연결된 N- 말단 전사 활성화 도메인으로 구성된 유사한 도메인 구조를 가지고 있습니다. p53, p63 및 p73이 별개의 전사 프로그램을 시작할 수 있음에도 불구하고 세 가지 p53 계열 전사 인자 모두 동일한 DNA 서열을 인식합니다. 그러나 최근 Harms et al.에서 검토 한 바와 같이 세 가지 단백질 모두에 의해 조절 될 수있는 많은 공통 유전자가 있습니다. (2004).따라서 p53이 p73 delta N의 전사를 활성화 할 때 p73 delta N 단백질은 많은 p53- 조절 유전자에 결합 할 수 있지만 transactivation 도메인이 없으면 p53 전사 활성화의 억제 자 또는 경쟁자 역할을합니다. 이러한 방식으로 부정적인 피드백 루프가 설정되고 p53 활동이 감소합니다 (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (그림 9). 따라서 이러한 긍정적 또는 부정적 피드백 회로 중 5 개 (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF)는 다른 신호 전달 경로의 중심 구성원 인 유전자와 단백질을 포함하는 반면 2 개 (cyclin G 및 p73 델타 N) 직접적인 네거티브 피드백 루프를 형성합니다.

토론 할 최종 네거티브 피드백 루프는 유비퀴틴 리가 제 형태로 제공됩니다. 놀랍게도 세 가지 다른 p53- 유비 쿠틴 리가 제 활성 (MDM-2, Cop-1 및 Pirh-1)이있는 것으로 보이며, 각각은 자동 조절 루프를 형성하여 p53 활성을 낮 춥니 다 (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (그림 10). 각 유전자는 p53에 의해 전사적으로 활성화됩니다. 이러한 수준의 중복성이있는 이유는 현재 명확하지 않습니다. 여러 가지 가능성은 이러한 유전자 산물이 다른 세포 또는 조직 유형에서 또는 심지어 다른 발달 단계에서 발현되거나 최적으로 작용한다는 것입니다. 예를 들어, MDM-2 녹아웃 마우스는 배반포 이식 직후 수정 후 약 6 일에 치명적입니다. 이것은 그 단계에서 발생해야하는 저산소증에 의해 촉발 될 수 있으며, MDM-2가 없을 때 p53을 활성화하고 세포 사멸을 유발합니다. 이 해석과 일치하는 것은 p53, MDM-2 이중 녹아웃 마우스가 생존 가능하고 p53 녹아웃 마우스처럼 정상적으로 태어났다는 관찰입니다 (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). 따라서 이것은 MDM-2 단백질이 배반포 단계에서 백업 유비퀴틴 리가 제 활성없이 작용한다는 생각과 일치하지만, 이러한 다른 단백질은 발달의 후기 단계에서 더 정상적인 기능을 허용 할 수 있습니다. 이제 이러한 아이디어를 테스트 할 수 있습니다. 이 세 가지 유비퀴틴 리가 제 중 하나 이상이 비 스트레스 또는 기저 상태에서 p53 수준의 유지에 관여하는 반면 다른 것들은 스트레스 유발 p53이 생성 된 후에 만 작용할 수도 있습니다. 활성화 된 p53과 스트레스 유발 p53 단백질은 단백질 변형이 매우 다르며 이것이 MDM-2, Cop-1 또는 Pirh-2의 활성에 미치는 영향은 현재 명확하지 않습니다. 이 세 가지 유비퀴틴 리가 각각은 세포에서 단백질 복합체를 형성하고 관련 단백질은 이들 리가 각각에 대해 잘 다를 수 있으며 서로 다른 조절 회로에 연결됩니다. 현재 MDM-2에 대한 많은 정보가 알려져 있으며, 지난 1 년 동안 문헌에보고 된 Cop-1과 Pirh-2의 역할에 대해서는 상대적으로 초점을 맞추지 않았습니다. 또한 최근에 p53은 또 다른 E3 유비퀴틴 리가 제 효소 인 topors의 기질 인 것으로 나타났습니다 (Rajendra et al., 2004). topors가 또한 p53의 전사 표적인지 여부는 아직 결정되지 않았으므로 p53 경로의 자동 조절 제어에 기여하는 증가하는 단백질 목록에 추가되어야합니다. 향후 몇 년간의 연구에서는 이러한 질문을 다루어야합니다.

위에서 언급했듯이 많은 규제 루프에는 MDM-2가 관련되어 있으므로 p53 활동 제어에서 MDM-2의 중심 역할을 강조합니다. 이 단백질 복합체를 차단하는 p53 및 MDM-2 돌연변이의 유전 적 분석은이 결합 상호 작용에 중요한 각 단백질의 중요한 아미노산 잔기를 확인했습니다 (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). 이러한 동일한 아미노산 잔기는 HDM-2 (인간 단백질)의 아미노-말단의 결정 구조와 p53의 아미노-말단의 펩타이드에서 이러한 단백질 접촉을 만드는 것으로 나타났습니다 (Kussie et al., 1996). . p53의 잔류 물인 페닐알라닌 19, 트립토판 23 및 류신 26은 MDM-2 소수성 포켓에서 주요 접촉을 형성합니다. 잔기 세린 20 및 아마도 세린 15의 인산화는 이러한 접촉을 약화시켜야하며, 이들 접촉과 경쟁하는 펩티드 및 약물은 p53 MDM-2 복합체를 차단하고 세포에서 세포 사멸을 촉진한다 (Klein and Vassilev, 2004). 따라서 p53-MDM-2 복합체와 MDM-2 유비퀴틴 리가 아제 활성은 일부 암의 주요 약물 표적이되었습니다. 인간 육종의 약 1/3과 일부 백혈병 및 교 모세포종에서 HDM-2 유전자가 증폭되어이 단백질이 과발현됩니다. p53 유전자는 야생형이고 p53 단백질은 분명히 비활성 상태이므로 p53-HDM-2 복합체를 파괴하는 약물은 p53을 활성화해야합니다. 또한 다른 많은 암들은 HDM-2 유전자가 증폭되지 않더라도 HDM-2 유전자 산물을 높은 수준으로 발현하는 것으로 보입니다. 이러한 유형의 암에서 HDM-2 활성을 차단하거나이 복합체에서 p53을 제거하면 암세포에서 선택적으로 세포 사멸을 잘 유도 할 수 있습니다. 이것은 또한 p53을 활성화하는 일부 약물의 화학 요법 활성을 향상시킬 수 있습니다.

p53-MDM-2 자동 조절 루프는 p53 및 MDM-2 레벨이 시간에 따라 증가 및 감소하고 셀에서 위상이 다른 오실레이터를 설정할 것으로 예상됩니다. 이것은 p53 스트레스 반응을 겪는 배양에서 세포의 단백질의 웨스턴 블롯을 사용하여 MDM-2 및 p53 수준을 측정함으로써 처음 입증되었습니다 (Lev Bar-Or et al., 2000). 진동이 관찰되고 시간이 지남에 따라 감쇠되는 동안,이 실험은 진동에서 위상이 다를 수있는 배양중인 많은 세포의 단백질 농도를 평균하여 건설적 또는 파괴적 간섭을 유발합니다. 이러한 이유로, 형광 태그가 지정된 p53 및 HDM2 융합 단백질은 p53 스트레스 반응을 겪는 세포에서 p53 및 HDM-2 수준의 변화를 추적하기 위해 개별 세포에서 이미지화되었습니다. 예상 밖의 위상 진동이 관찰되었으며 놀랍게도 세포의 진동 수는 이러한 세포에 주어진 방사선 량에 비례했습니다 (Lahav et al., 2004). 이것은 p53이 아날로그 방식 (더 높은 p53 농도)이 아닌 디지털 방식 (진동 수)으로 스트레스 신호의 강도를 측정 할 수 있음을 시사합니다. 유사한 진동이 NF-κ-B 및 I-κ-B 단백질이있는 NF-κ-B 경로와 같은 음성자가 조절 루프를 갖는 다른 신호 전달 경로에서 관찰되었습니다 (Scott et al., 1993). 전사 인자 양의 진동으로 인한 이러한 디지털 신호는주기적인 유전자 발현 패턴을 생성 할 수 있습니다. 그러나 전사 인자 수준의 디지털 신호가 유전자에 의해 생성되는 mRNA 양 수준에서 어떻게 아날로그 신호로 변환되는지는 명확하지 않습니다. 이러한 실험은 다양한 진동 수, 진동의 타이밍 또는 파장 또는 이러한 진동의 진폭이 선택된 유전자 발현 패턴 및 p53의 결과 (세포주기 정지, 세포 사멸 또는 노화)에 영향을 미칠 수있는 가능성으로 이어집니다. 응답.

p53 경로에 피드백 루프가 많은 이유는 무엇입니까? 이 질문에 대한 많은 답변이 있습니다. 모든 메커니즘은 동일한 세포 또는 조직 유형에서 또는 발달 중에 동일한 단계에서 활성화되지 않을 수 있습니다. 여기에 설명 된 유형의 피드백 루프는 p53 경로를 다른 신호 전달 경로와 연결하고 성장 및 분열을 위해 세포 신호를 조정하는 수단을 제공합니다. 시스템의 중복은 때때로 오류를 방지 할 수 있으며 백업 시스템은 돌연변이 표현형을 줄입니다. 반면에 그림 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10에 표시된 모든 피드백 루프가 시간 테스트 및 추가 실험을 견딜 수있는 것은 아닙니다. 이러한 경로의 대부분은 이러한 경로를 변경하는 돌연변이가있는 배양 물에서 암세포로 수행 된 실험에 의해 밝혀졌습니다. 배양 또는 녹아웃 마우스의 정상 세포 (돌연변이에 대한 수용으로 인해)조차도 생체 내 정상 세포 및 기관에서 발생하는 모든 조건을 반영하지 못할 수 있습니다. 특정 단백질 키나아제 또는 포스 파타 아제가 생체 내에서 특정 기질에 작용하고 정량적으로 측정 할 수있는 결과가 있다는 것을 증명하는 것은 특히 어렵습니다. 따라서 우리는 세포에서 작동한다고 믿는 기능과 경로를 계속해서 테스트하고 도전해야합니다. 그러나 그림 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10에 표시된 이러한 구성은 암의 본질과 약물 및 약물의 설계에 대한 새로운 통찰력으로 이어지는 가설을 공식화하고 아이디어를 테스트하는 데 유용합니다. 암세포를 선택적으로 죽이는 약제