Definisjon
DNA-polymerase er en viktig enzymgruppe involvert i DNA-syntese, reparasjon og replikering; disse enzymene finnes i alle levende organismer. Opprinnelig oppdaget under forskning på Escherichia coli-bakterier, vi vet nå om flere varianter med lignende strukturer, men forskjellige funksjoner. Disse variantene er gruppert i familier etter funksjon og brukes også innen genteknologi.
DNA-polymerasefunksjon
DNA-polymerase har varierende roller i mekanismene for DNA-syntese, reparasjon og replikering. DNA-polymerase er kategorisert i syv forskjellige familier i eukaryoter, virus, gjær og bakterier. Disse syv familiene er A, B, C, D, X, Y og revers transkriptase (RT). Fremtidig forskning kan oppdage flere grupper.
Hver av disse familiene inneholder en delmengde av DNA-polymeraser som har sitt eget funksjonsområde. For eksempel er DNA-polymerase I et medlem av A-familien; DNA-polymerase IV eller DinB er medlem av X-familien. Du trenger ikke huske hvert navn, men den grunnleggende funksjonen per gruppe vil også hjelpe deg med å bedre forstå proteinsyntese, genmutasjon og genmodifisering.
Strukturen til DNA-polymerase blir sammenlignet med en høyre hånd med en håndflate, fingre og tommel. Du kan forestille deg en DNA-streng som beveger seg gjennom et DNA-polymerasemolekyl som båndet gjennom en skrivemaskin. Svært enkelt sagt, fingrene hjelper til med å nøye posisjonere den utpakkede DNA-strengen ved å gjenkjenne nukleotidene, håndflaten er det aktive stedet der fosforylering oppstår (tilsetning av fosfat-ryggraden), og tommelen binder DNA til en dobbel-helixform når den kommer ut DNA-polymerasemolekylet. Men ikke alle DNA-polymerasefamilier har de samme strukturelle komponentene. La oss se på de forskjellige familiene litt mer detaljert.
Polymerasefamilie A
Familie A er en gruppe DNA-replikasjons- eller DNA-reparasjonsenzymer. I DNA-replikasjon matcher de en nukleotidbase til riktig partner. Dette er nødvendig når en celle forbereder seg på å dele seg, og det enkeltstrengede kromosomet dupliseres slik at begge celler, mor og datter, har et komplett sett med DNA.
Hvis en kopi av DNA skal lages, kjører DNA-polymerasemolekyler over den utpakede malstrengen og kopierer den med motsatte nukleotider. Dette produserer en nøyaktig kopi av den kodende DNA-strengen. Ulike familie A-enzymer hjelper mot DNA-reparasjon – de sjekker nyproduserte tråder for feil baser og erstatter dem hvis feil blir funnet.
Eksempler på familie A DNA-polymeraser er Pol I, Pol γ (gamma) og Pol θ (theta). Ofte referert til som Pol I-familien (Pol er en forkortelse for polymerase), hver undertype har en spesifikk handling.
Du kan alltid fortelle om en DNA-polymerase finnes i prokaryote eller eukaryote celler ved å se på navnene deres. Når en polymerase tildeles romertall (Pol III, Pol I og så videre), finnes det enzymet i prokaryote (encellede) organismer. I eukaryoter blir undertyper navngitt etter det greske alfabetet (Pol delta, Pol theta, og så videre). Familier kan inneholde DNA-polymeraser for enkelt- og / eller flercellede organismer.
Pol γ er den eneste DNA-polymerase som kan replikere mitokondrie-DNA (og bare familie X DNA-polymeraser utfører mtDNA-reparasjon).
Pol theta (DNA polymerase theta) reparerer dobbeltstrengede brudd i DNA ved å gjenforene de ødelagte endene. Skader på genet som koder for Pol theta (θ) produksjon, betyr at pauser begynner å hoper seg opp uten å bli reparert; theta-mediert endeforbindelse (TMEJ) øker imidlertid risikoen for mutasjon sammenlignet med noen andre DNA-reparasjonsmekanismer. På grunn av dette har defekte Pol θ-gener vært knyttet til mange former for kreft.
På grunn av slike studier på sykdom og DNA har familie A DNA-polymeraser hjulpet oss til å forstå og behandle ulike former for kreft. Et annet A-familieeksempel er Pol nu som hjelper til med å løsne interstrand-tverrbindinger (ICL). Hva er en tverrbinding mellom strenger? Har du noen gang hørt om sennepsgass som ble brukt i andre verdenskrig? Å puste denne gassen i store mengder kan drepe, men tusenvis av soldater overlevde eksponering. Etter hvert som tiden gikk, fant legene at disse modige mennene var mer sannsynlig å dø av kreft i luftveiene enn mennesker som aldri hadde blitt utsatt for sennepsgass.Gassen kom inn i lungene og reagerte direkte med DNA fra lungeceller, og bundet sammen en nukleotidstreng til motsatte nukleotider som ikke var deres partnere (diagonale eller tverrbindinger). Disse ekstra bindingene gjorde det vanskelig å pakke ut DNA før replikasjon, og når replikering skjedde ble det gjort feil i kopiering av koden. Disse feilene multipliserte seg over tid og forårsaket mange DNA-feil som ble kopiert og forårsaket genmutasjoner. Disse mutasjonene førte til produksjon av defekte celler eller kreft. Når det gjelder sennepsgass, var dette lungekreft.
Pol nu (POLν) er spesielt produsert for å prøve å løse disse svært skadelige interstrand-tverrbindinger. Det er ikke laget i store mengder og ser ut til å være mer et backup-enzym, men det kan være mer enn det. Selv om det bare ble oppdaget i 2003, får mindre kjente DNA-polymeraser som Pol nu mye oppmerksomhet. En av årsakene er at rundt 50% av brystkreftcellene viser slettede områder på cytogen plassering (posisjon) 4p16.2 – det er kromosom 4, kort arm (p), region 16, bånd 2). På bildet nedenfor er det posisjonen lengst til venstre. Det er også viktig å merke seg at det er akkurat der genet for Pol nu-syntese er lokalisert.
Polymerase-familie B-funksjon
DNA-polymerase B-familieenzymer er viktige under prosessen med celledeling. De sjekker nylig replikert og syntetisert DNA. Familien inkluderer både prokaryot- og eukaryotepolymeraser.
Pol alpha (et gresk brev, så en eukaryotpolymerase) starter DNA-replikasjonsprosessen og kommuniserer områder med skade på andre B-familie-DNA-polymeraser som Pol delta og Pol epsilon. Fordi disse feilene blir løst med en gang, er det mye mer sannsynlig at de lykkes, og risikoen for feilparring (å matche feil nukleotid til en skadet DNA-streng) er lav.
Et eksempel på feilparring er erstatning av et tidligere bundet guanin- og tyminpar for å produsere et guanin- og cytosinpar i DNA, der tymin er feil substituert med cytosin. Bakterielle og eukaryote DNA-polymeraser er sentrale for både skadegjenkjennings- og skadereparasjonsmekanismer.
Polymerase Family C-funksjon
Mens DNA-polymerase C-funksjoner bare finnes i bakterier, bør vi aldri glemme at bakterier overstiger menneskelige celler med ti til en på og innenfor gjennomsnittskroppen. De fleste av disse er avgjørende for helsen vår, hjelper fordøyelsessystemet og produserer kjemikalier som forbedrer system- og organfunksjonen. Mindre ofte koloniserer patogene bakterier for å gi symptomer på sykdom og sykdom. Familie C – ofte referert til som PolC – er den viktigste bakterielle DNA-replikasjonspolymerasegruppen. Familie C er ikke en reparasjonspolymerase.
Med medikamentresistente bakterier økende, blir nye antibakterielle midler mer og mer nødvendige. Nye forskningsområder inkluderer utvikling av antibiotika som direkte retter seg mot PolC. Dette potensielle nye bredspektrede medikamentet kan forhindre replikering i alle typer bakterier, sunne og patogene, men enda viktigere, disse stoffene – som fremdeles er i de tidligste stadiene av utviklingen – unngår mekanismene som fører til bakteriell antibiotikaresistens.
Polymerase-familie D-funksjon
Euryarchaeota beskriver en gruppe gram-positive og gram-negative bakterier som ofte sies å foretrekke ekstreme miljøer (ekstremofiler). Imidlertid lever disse bakteriene og formerer seg i alle slags miljøer, fra dype marine silter til fordøyelsessystemene våre. De bruker D-familie DNA-polymeraser (PolD) for DNA-replikasjon. Mutasjonshastigheter i denne gruppen er veldig høye sammenlignet med de for PolB DNA-polymeraser. Og i motsetning til andre polymeraser har ikke familie D en håndlignende struktur, sannsynligvis fordi disse cellene evolusjonært sett er veldig tidlige celletyper.
Polymerase Family X Funksjon
X familien av DNA-polymerase er begrenset til eukaryote celler og spiller både replikasjons- og reparasjonsroller. Noen jobber med å reparere mitokondrie-DNA der miljøer med høy oksidasjon oppmuntrer til DNA-skade. Andre reparerer en til (omtrent) ti påfølgende nukleotider i DNA i cellekjernen. Metoden for reparasjon (base excision repair) i mitokondrion og kjerne er lik. Base excision repair (BER) er en prosess som bruker forskjellige typer enzymer, inkludert DNA-glykosylase og endonukleaser. Det er X-familie DNA-polymerase (Pol beta og Pol lambda) som danner det aktive stedet for denne reparasjonen og setter inn riktig nukleotid. Hvis genet for X-familie DNA-polymeraser blir skadet, påvirkes BER-prosesser negativt, og dette er forbundet med visse typer kreft.Noen nye målrettede terapier som er utviklet for disse kreftformene, hemmer defekte reparasjonsmekanismer for baser.
Polymerasefamilie Y-funksjon
DNA-polymerase Y-familien er et replikasjons- og reparasjonsenzym som finnes i eukaryote og prokaryote celler. Alle disse polymerasene er veldig utsatt for feil med hensyn til deres rolle i replikering og umiddelbar reparasjon eller omgåelse av defekte DNA-sekvenser. Likevel kan for lave nivåer av denne familien av polymeraser samtidig øke ens følsomhet for ondartede svulster. Dette er grunnen til at Y-familien noen ganger blir sammenlignet med et tokantet sverd.
Y-familiegruppen aktiveres når andre DNA-polymeraser ikke klarer å få effekt. Det skal være en sikkerhetskopimekanisme; dette kan forklare hvorfor mutasjoner som følger denne typen reparasjoner er mer vanlige.
Reverse Transcriptase Function
Virus, retrovirus og eukaryote celler inneholder RNA-avhengige revers transkriptaseenzymer. Disse enzymene – en del av DNA-polymerasegruppen – er det som gjør virus farlige. Ettersom et virus bare inneholder RNA, må det lure en mikroorganisme eller celle til å reprodusere det. Hvis cellene våre bare kopierte RNA, kan de produsere ett eller to uvanlige proteiner i et ribosom, men disse vil ikke hjelpe viruset til å formere seg. I stedet må virus-RNA på en eller annen måte gjøre seg selv en del av DNA-malen slik at cellen gjennomgår permanente endringer. Det gjør dette ved å bruke revers transkriptaseenzymer.
Disse enzymene produserer dobbeltstrenget DNA fra en enkeltstrenget RNA-mal i en prosess kjent som revers transkripsjon. Mutasjoner er vanlige. Bildet nedenfor viser hvordan det humane immunsviktviruset replikerer i en T-lymfocytt. Omvendt transkripsjon initierer vekst av viruset ved å lure cellen til å produsere komponenter som samles for å danne flere virus fra redigert DNA.
De fleste revers transkripsjonsprosesser er resultatet av skadelige virusinfeksjoner, der enkeltstrenget viralt RNA blir kopiert for å danne en dobbel DNA-streng som vil fortsette å lage virale proteiner. Dette gjøres med revers transkriptase (revers fordi den vanlige metoden er å bruke dobbeltstrenget DNA for å produsere en enkelt streng av RNA).
Testing under COVID-19 (SARS-CoV-2) i 2020 – som med alle virusinfeksjonstester – krever viral RNA-ekstraksjon. Laboratorier bruker en prosess som kalles revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (rt-PCR). Rt-PCR er ikke så komplisert å forstå som det kan høres ut. Denne testen produserer komplementært DNA (cDNA) eller DNA som kopieres fra små mengder viralt RNA. Siden denne prosedyren bare produserer veldig små mengder cDNA, må resultatene forsterkes ved å replikere den. Når det er produsert i tilstrekkelige mengder, kan virusgenomet påvises.