Da den andre persiske invasjonen av Hellas startet i 481 f.Kr., ble Leonidas valgt til å lede de kombinerte greske styrkene, både på grunn av spartanernes rykte som et overlegen militær rike, og på grunn av sin egen dyktighet som general. Det sies at kongen besøkte Oraklet i Delfi, som ble konsultert om viktige statssaker i det antikke Hellas, og Oraklet leverte et stort vers som i det vesentlige fortalte ham at han måtte avgi livet for å forhindre at hans rike ble ødelagt av Persia.
I august 480 f.Kr. marsjerte Leonidas ut for å møte hæren til den persiske kongen Xerxes ved Thermopylae, en smal kystpassasje som lå på persernes rute innover i landet. Han hadde med seg bare 300 elite spartanske soldater og 900 slaver, som han la til da han marsjerte langrenn gjennom andre bystater, og endte med en total hær på mellom 4000 og 7000 mann. Ulike forklaringer har blitt fremmet på hvorfor styrken var så liten; Herodotus teoretiserte at spartanerne marsjerte rett ut slik at de ble sett for å ikke være redde, med forventning om at en større hær ville mønstres og ville følge kort tid etter, men moderne historikere mener interne stridigheter eller til og med det faktum at de olympiske leker ble holdt. på den tiden kunne ha vært å klandre.
Den persiske hæren de møtte var stort i antall. Herodot ‘estimat på to millioner menn har siden blitt avkreftet, men tallet var minst 70 000 og muligens opp til 300 000. En fire-dagers dødgang fulgte, og deretter angrep perserne på den femte dagen. I to dager holdt grekerne tilbake perserne og drepte omtrent 10 000 av mennene deres, inkludert to av kong Xerxes brødre. På den syvende dagen kontaktet en forræder ved navn Ephialtes den persiske generalen Hydarnes og viste ham en skjult vei som han kunne ta for å komme bak grekerne. Vel vitende om at han nå var overflankert, sendte Leonidas bort alle greske tropper, og valgte å forbli i passet med sine 300 spartanere og slaver, 400 Thebans og 700 Thespians.
Herodot skrev at Leonidas sendte mennene bort til sørge for at de ville leve for å kjempe en annen dag og være nyttige i en fremtidig kamp mot perserne, og spartanerne ble værende for å beskytte grekernes flukt og fordi de aldri kunne forlate sin posisjon på slagmarken. Thespianerne skulle ha blitt sendt bort med de andre grekerne, men ble liggende etter egen vilje.
Xerxes tilbød angivelig å skåne spartanernes liv hvis de ga opp våpnene, som Leonidas svarte » ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(kom og ta dem). Mennene kjempet da et bittert siste standpunkt mot perserne, og alle ble drept bortsett fra de 400 Thebans, som overgav seg til perserne uten kamp. Etter at Leonidas ble drept, kjempet spartanerne for å hente ut kroppen hans og hindre perserne i å vanhelge den. Leonidas var omtrent 60 år gammel da han døde, og han ble etterfulgt av sønnen Pleistarchus.