p53-banen: positive og negative tilbakemeldingsløkker

En rekke studier i litteraturen har identifisert 10 positive eller negative tilbakemeldingsløkker i p53-banen (se figur 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10). Hver av disse sløyfene skaper en krets sammensatt av proteiner hvis aktivitet eller syntesehastigheter er påvirket av aktivering av p53, og dette resulterer igjen i endring av p53-aktivitet i en celle. Av disse er syv negative tilbakemeldingsløkker som modulerer ned p53-aktivitet (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyclin G, Wip-1 og Siah-1) og tre er positive tilbakemeldingsløkker (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF og Rb) som modulerer opp p53-aktivitet. Alle disse nettverkene eller kretsene er autoregulerende ved at de enten er indusert av p53-aktivitet på transkripsjonsnivå, transkripsjonelt undertrykt av p53 (p14 / 19 ARF, figur 3) eller er regulert av p53-induserte proteiner. Seks av disse tilbakemeldingsløkkene fungerer gjennom MDM-2 (MDM-2, cyclin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT og Rb) for å modulere p53-aktivitet.

Et spennende funn er at p53-banen er nært knyttet til annen signaltransduksjon veier som spiller en viktig rolle i opprinnelsen til kreft. En av de første forbindelsene som ble undersøkt involverer p14 / p19ARF og MDM-2. P14 / 19 ARF-proteinet binder seg til MDM-2-proteinet og modulerer ned sin ubiquitinligaseaktivitet, og øker nivåene av p53-proteinet (Honda og Yasuda, 1999) (figur 3). Transkripsjonen av p14 / 19 ARF-genet blir positivt regulert av E2F-1 (Zhu et al., 1999) og beta-catenin (Damalas et al., 2001) og negativt regulert av p53 i seg selv. I tillegg økes nivåene av p14 / 19 ARF-protein av Ras og Myc-aktiviteter i en celle (figur 3). Kompleksiteten i reguleringen av p53 av p14 / p19 ARF har nylig blitt gjennomgått (Lowe og Sherr, 2003). P14 / 19 ARF-MDM-2-kompleksene er ofte lokalisert i cellekjernen på grunn av de nukleolare lokaliseringssignalene som er tilstede i p14 / p19 ARF. Nukleolus er stedet for ribosomal biogenese og p14 / 19 ARF-aktivitet i seg selv kan endre hastigheten på RNA-prosessering av ribosomal RNA-forløperen til modne ribosomale underenheter (Sugimoto et al., 2003). Dermed spiller p14 / 19 ARF ved å kontrollere MDM-2 og p53 nivåer og koordinere dette med ribosomal biogenese en viktig rolle i cellesyklusregulering. Dette har nylig blitt forsterket av demonstrasjonen om at p14 / 19 ARF-proteinet også kan regulere Myc-aktivitet (og derfor cellestørrelse) (Datta et al., 2004). MDM-2 i nucleolus er imidlertid ikke en passiv enhet. MDM-2-proteinet har vist seg å binde seg spesifikt til tre store ribosomale underenhetsproteiner L5, L11 og L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), og bindingen av L5 (Dai og Lu, 2004) eller L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) til MDM-2 senker sin ubiquitinligaseaktivitet. I tillegg binder ringfingerdomenet til MDM-2 spesifikt til en RNA-sekvens som finnes i den store ribosomale RNA-underenheten (Elenbaas et al., 1996). Mens alle disse observasjonene peker på en sentral rolle for MDM-2 og p14 / 19 ARF i reguleringen av ribosombiogenese og cellesyklusen, forstår vi ikke hvordan disse observasjonene kommer sammen for å danne denne reguleringssløyfen.

Rb-proteinet kan bli funnet i celler i et kompleks med MDM-2 og p53, noe som resulterer i høy p53-aktivitet og forbedret apoptotisk aktivitet (Xiao et al., 1995). Høye nivåer av aktiv E2F-1 som ikke er bundet til Rb, bytter p53-responsen fra G-1-arrest til apoptose. Både Rb og MDM-2 er fosforylert og inhibert av cyclin E-cdk2 (figur 4). Når p53 aktiveres, stimulerer det syntesen av p21-proteinet, som hemmer cyclin E-cdk2-aktivitet, og dette virker igjen på Rb-MDM-2-komplekset som fremmer p53-aktivitet og apoptose. Etter DNA-skade blir både MDM-2-proteinet og p53-proteinet modifisert av ATM-proteinkinasen (figur 4). Dette forbedrer p53-aktivitet på samme måte som p53-MDM-2-Rb-komplekset øker p53-funksjonen og er proapoptotisk. For en detaljert nylig gjennomgang av p53-Rb-E2F1-aksen, se Yamasaki (2003).

En del av aktiveringen av p53-proteinet involverer fosforylering av p53-proteinet ved seriner lokalisert ved rest 33 og 46 av p38 MAP-kinase (figur 5). Denne p38 MAP-kinasen aktiveres i seg selv av fosforylering (regulert av Ras-Raf-Mek-Erk-banen) som kan reverseres eller inaktiveres av Wip-1-fosfatasen. Wip-1 er et p53-responsivt eller p53-regulert gen som danner en negativ autoregulatorisk sløyfe og forbinder p53- og Ras-stiene (Takekawa et al., 2000) (figur 5). Et aktivert p53-protein regulerer transkripsjonen av ubiquitinligasen Siah-1 positivt (Fiucci et al., 2004), som igjen virker for å nedbryte beta-catenin-proteinet (Iwai et al., 2004) (figur 6). Beta-cateninnivåer kan regulere p14 / 19 ARF-genet, som igjen regulerer MDM-2 negativt og resulterer i høyere p53-nivåer (en positiv tilbakemeldingssløyfe) (figur 6). Siah-1 forbinder dermed Wnt-beta-catenin-APC-banen til p53-banen. I noen celletyper induserer p53-protein transkripsjon av PTEN-genet (figur 7). PTEN-proteinet er en PIP-3 fosfatase. PIP-3 aktiverer AKT-kinasen, som har et antall antiapoptotiske proteinsubstrater inkludert MDM-2-proteinet. Fosforylering resulterer i translokasjon av MDM-2 til kjernen der den inaktiverer p53 (figur 7). Dette forbinder p53-banen med IGF-1-AKT-banen og danner en positiv tilbakemeldingssløyfe for forbedret p53-aktivitet og redusert AKT-aktivitet. Denne løkken i p53-regulering har også nylig blitt gjennomgått (Gottlieb et al., 2002). Disse positive og negative tilbakemeldingsløkkene oppnår to ting: (1) de modulerer p53-aktivitet i cellen og (2) de koordinerer p53-aktivitet med andre signaltransduksjonsveier som regulerer celleinngang i cellesyklusen (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenin, IGF-1 og cyclin E-cdk2-aktiviteter).

Det er to ekstra p53 autoregulatoriske kretser som gir negativ tilbakemelding på p53-funksjon. En av de mest aktive av de p53-responsive genene er cyclin G-genet. Det transkriberes raskt til høye nivåer etter p53-aktivering i et stort utvalg av celletyper (Okamoto og Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). Cyclin G-proteinet lager et kompleks med PP2A-fosfatase, som fjerner en fosfatrest fra MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (figur 8), som tilsettes MDM-2-proteinet av en cdk-kinase (Zhang og Prives, 2001) (figur 4). Fosforylering av MDM-2 av cyclin A / cdk2 hemmer dens aktivitet, og dermed forbedrer cyclin G-PP2A fosfatase MDM-2 aktivitet og hemmer p53. Mus med cyclin G-genet slått ut er levedyktige (Kimura et al., 2001), og cyclin G null musembryofibroblaster har forhøyede p53-proteinnivåer i fravær av stress (Okamoto et al., 2002), og viser at denne tilbakemeldingssløyfen er operativ in vivo og virker på basalnivåene av p53 i en celle, ikke bare de høyere p53-aktiverte nivåene etter stress. Den andre negative tilbakemeldingssløyfen involverer et medlem av p53-familien av transkripsjonsfaktorer, som inkluderer p53, p63 og p73 som er relatert av struktur og funksjon og har utviklet seg fra en felles forløper. Etter en stressrespons aktiveres p53-genet, som igjen stimulerer transkripsjonen av et bestemt spleiset m-RNA fra p73-genet, kalt p73 delta N (figur 9). Dette oversetter et p73-protein uten dets aminoterminale domene. Alle tre av p53-familien av proteiner har lignende domenestrukturer sammensatt av et N-terminal transkripsjonelt aktiveringsdomene koblet til et sentralt kjernedomene som binder seg til en spesifikk DNA-sekvens diskutert ovenfor. Alle tre av p53-familiens transkripsjonsfaktorer gjenkjenner den samme DNA-sekvensen, selv om p53, p63 og p73 er i stand til å initiere forskjellige transkripsjonsprogrammer. Det er imidlertid et stort antall vanlige gener som kan reguleres av alle tre proteiner som nylig gjennomgått i Harms et al. (2004).Når p53 således aktiverer transkripsjonen av p73 delta N, kan p73 delta N proteinet binde seg til mange av de p53-regulerte genene, men fraværet av et transaktiveringsdomene får det til å fungere som en repressor eller konkurrent til p53-transkripsjonsaktivering. På denne måten settes det opp en negativ tilbakemeldingssløyfe og p53-aktivitet avtar (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (Figur 9). Dermed involverer fem av disse positive eller negative tilbakemeldingskretsene (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) gener og proteiner som er sentrale medlemmer av andre signaltransduksjonsveier, mens to (cyclin G og p73 delta N) danner direkte negative tilbakemeldingsløkker.

De siste negative tilbakemeldingsløkkene som skal diskuteres kommer i form av ubikvitinligaser. Overraskende ser det ut til å være tre forskjellige p53-ubiqutin ligaseaktiviteter (MDM-2, Cop-1 og Pirh-1), som hver danner en autoregulerende loop som resulterer i lavere p53-aktivitet (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (Figur 10). Hvert gen aktiveres transkripsjonelt av p53. Bare hvorfor det er dette nivået av redundans er for tiden uklart. Flere muligheter er at disse genproduktene uttrykkes eller virker optimalt i forskjellige celle- eller vevstyper eller til og med på forskjellige stadier av utvikling. For eksempel er MDM-2 knockout-musen dødelig omtrent 6 dager etter befruktning bare ved implantasjon av blastocyst. Dette kan utløses av hypoksi som må oppstå på det stadiet, og aktiverer p53 i fravær av MDM-2 og forårsaker apoptose. I samsvar med denne tolkningen er observasjonen at en p53, MDM-2 dobbel knockout-mus er levedyktig og er født så normalt som en p53 knockout-mus (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Dette er derfor i tråd med ideen om at MDM-2-proteinet virker uten en backup ubiquitin ligase-aktivitet i blastocyst-stadiet, men disse andre proteinene kan tillate mer normal funksjon i senere utviklingsstadier. Disse ideene er nå testbare. Det er også mulig at en eller flere av disse tre ubikvitinligasene er involvert i opprettholdelsen av p53-nivåer i ikke-belastet eller basal tilstand, mens andre bare virker etter at en stressindusert p53 er produsert. De aktiverte p53 og de stressinduserte p53-proteinene har svært forskjellige proteinmodifikasjoner, og virkningen av dette på aktiviteten til MDM-2, Cop-1 eller Pirh-2 er for tiden uklar. Det ser ut til å være sannsynlig at hver av disse tre ubikvitinligasene danner proteinkomplekser i cellen, og de tilknyttede proteinene kan godt variere for hver av disse ligasene og koble dem til forskjellige regulatoriske kretser. For tiden er det mye kjent om MDM-2, og relativt lite fokus har blitt lagt på rollen som Cop-1 og Pirh-2, som bare er rapportert i litteraturen det siste året eller så. I tillegg ble det nylig vist at p53 var substratet for enda et E3 ubiquitin ligaseenzym, toporer (Rajendra et al., 2004). Det gjenstår å avgjøre om toporer også er et transkripsjonsmål for p53, og dermed bør legges til den voksende listen over proteiner som bidrar til autoreguleringskontroll av p53-banen. De neste årene av studien bør ta opp disse spørsmålene.

Som nevnt ovenfor involverer mange av reguleringssløyfene MDM-2, og fremhever dermed den sentrale rollen som MDM-2 i kontrollen av p53-aktivitet. En genetisk analyse av p53- og MDM-2-mutasjoner som blokkerer dette proteinkomplekset, har identifisert kritiske aminosyrerester i hvert protein som er viktige for denne bindingsinteraksjonen (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Disse samme aminosyrerester har vist seg å danne disse proteinkontaktene i krystallstrukturen til aminoterminalen til HDM-2 (det humane proteinet) og et peptid fra aminoterminalen til p53 (Kussie et al., 1996) . Rester fenyalanin 19, tryptofan 23 og leucin 26 av p53 danner hovedkontaktene i MDM-2 hydrofob lomme. Fosforylering av restene serin 20 og muligens serin 15 bør svekke disse kontaktene, og peptider og medisiner som konkurrerer med disse kontaktene blokkerer p53 MDM-2-komplekset og fremmer apoptose i celler (Klein og Vassilev, 2004). Dermed har p53-MDM-2-komplekset og MDM-2 ubiquitin-ligaseaktiviteten blitt et viktig medikamentmål for noen kreftformer. I omtrent en tredjedel av humane sarkomer og i noen leukemier og glioblastomer er HDM-2-genet forsterket, og dette proteinet er overuttrykket. P53-genet er villtype og p53-proteinet er tilsynelatende inaktivt, slik at medisiner som bryter p53-HDM-2-komplekset skal aktivere p53. I tillegg ser det ut til at mange andre kreftformer uttrykker HDM-2-genproduktet på høye nivåer selv når HDM-2-genet ikke er amplifisert. I disse typer kreftformer kan blokkering av HDM-2-aktivitet eller frigjøring av p53 fra dette komplekset vel indusere apoptose selektivt i kreftcellene. Dette kan også forbedre den kjemoterapeutiske aktiviteten til noen legemidler som aktiverer p53.

P53-MDM-2 autoregulatorisk sløyfe er spådd å sette opp en oscillator med p53 og MDM-2 nivåer som øker og avtar med tiden og ut av fasen i cellen. Dette har blitt demonstrert først ved å måle MDM-2 og p53 nivåer ved bruk av Western blots av proteiner fra celler i kultur som gjennomgår en p53 stressrespons (Lev Bar-Or et al., 2000). Mens svingninger observeres og dempes med tiden, er gjennomsnittet av dette eksperimentet proteinkonsentrasjonen fra mange celler i kultur som kan være utenfor fasen i svingningene, noe som gir opphav til konstruktiv eller destruktiv interferens. Av denne grunn ble fluorescensmerkede p53- og HDM2-fusjonsproteiner avbildet i individuelle celler for å følge endringene i p53- og HDM-2-nivåer i celler som gjennomgikk en p53-stressrespons. De forventede svingningene utenfor fasen ble observert, og overraskende nok var antallet svingninger i en celle proporsjonal med stråledosen gitt til disse cellene (Lahav et al., 2004). Dette antyder at p53 kan måle intensiteten til et stressignal på en digital måte (antall svingninger) og ikke på en analog måte (høyere p53-konsentrasjoner). Lignende svingninger er blitt observert i andre signaltransduksjonsveier som har negative autoregulerende sløyfer, slik som NF-κ-B-banen med NF-κ-B og I-κ-B-proteiner (Scott et al., 1993). Disse digitale signalene som skyldes svingninger i mengden transkripsjonsfaktorer, kan godt resultere i et mønster av periodisk genuttrykk. Imidlertid er det fortsatt uklart hvordan digitale signaler på transkripsjonsfaktornivå blir oversatt til analoge signaler på nivået av mengden mRNA produsert av et gen. Disse eksperimentene fører til muligheten for at forskjellige antall svingninger, timing eller bølgelengde på svingningene eller amplituden til disse svingningene kan påvirke det valgte mønsteret for genuttrykk og utfallet (cellesyklusstans, apoptose eller senescens) av p53 svar.

Hvorfor er det så mange tilbakemeldingsløkker i p53-banen? Det er mange svar på dette spørsmålet. Alle mekanismene er kanskje ikke aktive i samme celle eller vevstype eller i de samme stadiene under utviklingen. Tilbakemeldingssløyfer av typen beskrevet her gir et middel til å koble p53-banen med andre signaltransduksjonsveier og koordinere cellesignalene for vekst og deling. Oppsigelser i et system kan noen ganger forhindre feil, og et backup-system reduserer fenotypen til mutasjoner. På den annen side kan ikke alle tilbakemeldingsløkkene vist i figurene 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tåle tidstesten og videre eksperimentering. Mange av disse banene er belyst ved eksperimenter utført med kreftceller i kultur som har mutasjoner som endrer disse banene. Selv normale celler i kultur eller knockoutmus (på grunn av tilpasning til mutasjonen) kan ikke gjenspeile alle forholdene som oppstår i normale celler og organer in vivo. Det er spesielt vanskelig å bevise at en spesifikk proteinkinase eller fosfatase virker på et spesifikt substrat in vivo og har et resultat som kan måles kvantitativt. Dermed må vi fortsette å teste og utfordre funksjonene og veiene vi mener opererer i en celle. Imidlertid er disse konstruksjonene, vist i figurene 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10, nyttige for å formulere hypoteser og teste ideer som helt sikkert vil føre til ny innsikt i kreftens karakter og utformingen av legemidler og midler som selektivt dreper kreftceller.