Porównawcza analiza fenotypowa i genomowa szczepów myszy C57BL / 6J i C57BL / 6N

Porównanie sekwencji genomu myszy C57BL / 6N i C57BL / 6J pod kątem SNP i małych indeli

Wykorzystaliśmy dopasowanie sparowanych końców C57BL / 6N do genomu odniesienia (C57BL / 6J) z projektu 17 Mouse Genomes Project. Jednak lista różnicujących wariantów (SNP, małe indele i SV) między dwoma genomami została nowo utworzona przy użyciu nowych wbudowanych procedur w celu zwiększenia prawdopodobieństwa zidentyfikowania dokładnych przypuszczalnych zmian sekwencji. Kluczowym etapem analizy w identyfikacji wysokiej jakości zestawu wariantów z dopasowania było wykorzystanie nowo wygenerowanej sekwencji genomu C57BL / 6J o krótkim odczycie wygenerowanej przez Broad Institute. To pozwoliło nam zidentyfikować błędy montażu w sekwencji referencyjnej. Ponadto zaktualizowaliśmy metodę wykrywania wariantów: po pierwsze, używając innego i / lub bardziej rozwiniętego oprogramowania do wykrywania wariantów; po drugie, wykonując ręczną selekcję wszystkich wariantów kodowania, a po trzecie, przez obszerną walidację dużej części wariantów (w tym wszystkich wariantów kodowania) w celu potwierdzenia przewidywanej sekwencji. Te kroki dostarczyły solidnego zestawu danych z wariantami kodowania wysokiej jakości, znacznie zmniejszając odsetek fałszywie dodatnich.

Aby zidentyfikować SNP i małe indele różnicujące szczepy C57BL / 6J i C57BL / 6N, użyliśmy sparowanych odczyty końcowe wygenerowane z projektu 17 Mouse Genomes Project. Nazwaliśmy warianty przy użyciu Genome Analysis Toolkit (GATK) i znaleźliśmy 681220 wariantów, które odróżniają szczepy C57BL / 6J i C57BL / 6N. Korzystając z krótkiego odczytu sekwencji genomu C57BL / 6J wygenerowanej przez Broad Institute, byliśmy w stanie odfiltrować potencjalne błędy sekwencjonowania, usuwając warianty wspólne dla sekwencji Broad C57BL / 6J, przeciwdziałając w ten sposób rozbieżnościom odniesienia, jednocześnie poprawiając fałszywie ujemne oceniać. Pozostałe odczyty zostały przefiltrowane przy stosunku alleli mniejszym niż 0,8 (heterozygotyczny) i pokryte mniej niż 3 lub większymi niż 150 odczytami. Te kroki znacznie zredukowały listę, dając 10 794 domniemanych wariantów, które zostały poddane dalszym analizom.

Korzystając z sekwencjonowania Sequenom, PyroSequencing i Sanger, zweryfikowaliśmy wszystkie warianty kodowania i podzbiór wariantów niekodujących, w tym 762 SNP i 169 małych indeli. Testy przeprowadzono przy użyciu panelu czterech próbek C57BL / 6J i czterech próbek C57BL / 6N w celu potwierdzenia genotypów (patrz Materiały i metody). Rozważaliśmy wariant do walidacji, gdy wszystkie cztery próbki C57BL / 6J i C57BL / 6N wykazały spójne genotypy w obrębie podszczepu i warianty między podszczepami. Podczas procesu walidacji wyeliminowaliśmy 363 warianty z wielu powodów, w tym heterozygotycznych i niespójnych genotypów oraz niepowodzeń PCR. W przypadku pozostałych 568, 236 zostało potwierdzonych jako wariant między podszczepami (patrz Dodatkowy plik 1, Tabela S1).

Przy użyciu programów do adnotacji NGS-SNP i Annovar, lokalizacja genomu i inne cechy genów zostały badany. Ostateczne zatwierdzone warianty sekwencji między C57BL / 6J i C57BL / 6N składały się z 34 kodujących SNP, 2 kodujące małe indele, 146 niekodujących SNP i 54 niekodujących małych indeli. Warianty kodujące obejmowały 32 missense SNP, 1 mutację nonsensowną, 1 mutację splicingową i 2 mutacje przesunięcia ramki (Tabela 1). Okazało się, że wszystkie warianty z wyjątkiem jednego (Zp2, chromosom 7) były prywatne dla C57BL / 6J lub C57BL / 6N i nie zostały znalezione w żadnym z 16 innych szczepów wsobnych, które ostatnio zsekwencjonowano.

Porównanie sekwencji genomu myszy C57BL / 6N i C57BL / 6J pod kątem wariantów strukturalnych

Ponownie, wykorzystując odczyty sparowanych końców wygenerowane z projektu 17 Mouse Genomes Project i kombinację czterech obliczeniowych zidentyfikowaliśmy 551 SV pomiędzy C57BL / 6J i C57BL / 6N. Jak opisano w innym miejscu, wizualnie zbadaliśmy mapowanie sparowanych końców z krótkim odczytem w tych 551 miejscach SV w 17 zsekwencjonowanych wsobnych szczepach myszy i w sekwencjonowanym genomie Broad J. W ten sposób byliśmy w stanie zachować 81 z 551 miejsc do dalszych analiz eksperymentalnych (470 przewidywanych miejsc okazało się fałszywych z powodu błędów mapowania sparowanych końców). Analizy sekwencjonowania oparte na PCR i Sanger w tych 81 zachowanych miejscach pozwoliły nam usunąć dalsze 38 miejsc, które zostały potwierdzone jako niepolimorficzne między C57BL / 6J i C57BL / 6N z powodu błędów odniesienia. Ostatecznie wszystkie 43 przewidywane warianty zostały zatwierdzone jako autentyczne SV różnicujące szczepy C57BL / 6J i C57BL / 6N (Tabela 2), co dało zerowy odsetek wyników fałszywie dodatnich.

Spośród 43 SV 15 pokrywa się z genem (Tabela 2), w tym 12 wariantów leżących w niekodujących regionach genów, 2 warianty wpływające na region kodujący genu (Vmn2r65 (Vomeronasal 2, receptor 65) i Nnt (transhydrogenaza nukleotydów nikotynamidowych)) oraz 1, który wpływa na cały gen Cyp2a22 (cytochrom P450, rodzina 2, podrodzina a, polipeptyd 22). Tylko 1 z 15 wariantów jest znany i został już powiązany z fenotypem Nnt; pozostałych 14 jest nowatorskich, a dla kilku omówimy ich potencjalne funkcje biologiczne poniżej.

Używając szczura jako gatunku z podgrupy, następnie wywnioskowaliśmy pochodzenie 43 SV między C57BL / 6J i C57BL / 6N, i stwierdzili, że 27 wariantów było produktem retrotranspozycji, 15 było SV bez powtórzeń, a 1 to powtórzenie tandemowe o zmiennej liczbie (VNTR) (Tabela 2). Co ciekawe, prawie wszystkie warianty były prywatne dla C57BL / 6J lub C57BL / 6N (Tabela 2).

Kompleksowa ocena fenotypowa myszy C57BL / 6N i C57BL / 6J

Równolegle z analizy genomowe konsorcjum European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) przeprowadziło kompleksowe porównanie fenotypowe szczepów C57BL / 6NTac i C57BL / 6J. EUMODIC składa się z czterech ośrodków zajmujących się myszami, które przeprowadzają szeroko zakrojone pierwotne fenotypowanie 500 mysich mutantów nokautowych linii wygenerowanych w ramach projektów European Conditional Mouse Mutagenesis (EUCOMM) i Knockout Mouse (KOMP) w ramach programu IKMC. Kohorty myszy z każdej linii mutantów wchodzą do oceny fenotypu European Mouse Phenotyping Resource of Standardized Screens slim (EMPReSSslim), która składa się z dwóch potoków fenotypowania, razem obejmujących 20 platform fenotypowych (identyfikowanych przez ESLIM__procedure_number), które są przeprowadzane od 9 do 15 tygodni (patrz Dodatkowy plik 2, Rysunek S1). Metody wykonywania każdego ekranu są szczegółowo opisane w standardowych procedurach operacyjnych (SOP), które można znaleźć w bazie danych EMPReSS. Uzyskano dane dotyczące 413 parametrów fenotypu wraz z 146 parametrami metadanych i wprowadzono do bazy danych EuroPhenome. W ramach tej pracy zgromadziliśmy obszerne dane kontrolne dotyczące podstawowego fenotypu C57BL / 6NTac. Skorzystaliśmy również z okazji, aby zbadać fenotyp myszy C57BL / 6J i porównać go z C57BL / 6NTac (odtąd określanym odpowiednio jako J i N).

Dla każdej linii, N i J, wiek myszy z dopasowaniem analizowano za pomocą obu potoków EMPReSSslim. Dane uzyskano ze wszystkich czterech ośrodków konsorcjum dla 19 z 20 platform z rurociągu, z wyłączeniem analiz sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (patrz Dodatkowy plik 2, Rysunek S1). Protokoły EMPReSSslim zostały rygorystycznie ujednolicone w konsorcjum EUMODIC; jednak istnieją pewne różnice, na przykład w sprzęcie i diecie, i jest to ujęte w zestawach metadanych w EuroPhenome. Będą oczywiście inne nierozpoznane różnice środowiskowe między ośrodkami. Łącznie mogą one przyczyniać się do różnic między genami a środowiskiem oraz wyników fenotypów, ale nie staraliśmy się systematycznie definiować tych skutków, zamiast tego skupiliśmy się na fenotypach, które są zgodne między ośrodkami i są wyraźnie odporne na nierozpoznane zaburzenia środowiskowe. Dane z kohort N i J z każdego ośrodka zostały zdeponowane w EuroPhenome i poddane analizie statystycznej dla każdego ośrodka (patrz Materiały i metody). W tym miejscu należy zauważyć, że porównania między N i J przeprowadzono wewnątrz, a nie między ośrodkami. Nie przeprowadzono analizy statystycznej wyników między ośrodkami, ponieważ eksperymenty nie mogły być całkowicie kontrolowane między ośrodkami z powodu zmiennych środowiskowych i innych oraz różnic w liczbie analizowanych zwierząt w każdym ośrodku (patrz Dodatkowy plik 3, Rysunek S2a-d). Dlatego zdecydowaliśmy się przyjąć podejście, które skupiało się na porównaniach szczepów w poszczególnych ośrodkach, w przeciwieństwie do generowania wieloośrodkowego modelu statystycznego, który badał ogólną różnicę statystyczną między dwoma szczepami. Jednak replikacja porównania N i J w wielu ośrodkach dostarczyła nam dodatkowej mocy w uzasadnieniu znaczących różnic fenotypowych między dwoma szczepami. Oprócz analizy N i J za pomocą rurociągu pierwotnego fenotypowania EMPReSSslim w czterech ośrodkach, inni partnerzy z konsorcjum EUMODIC zastosowali szerszy zakres często bardziej wyrafinowanych testów fenotypowych w celu zebrania dodatkowych informacji, z których część prowadzi dalsze badania i ma na celu uzasadnić różnice fenotypowe ujawnione przez EMPReSSslim.

Analizując dane, skupiliśmy się najpierw na identyfikacji parametrów fenotypu, które wykazały spójną i istotną różnicę między N i J w trzech lub więcej ośrodkach.Zidentyfikowaliśmy 27 parametrów fenotypu w tej klasie (Rysunek 1a; patrz Dodatkowy plik 3, Rysunek S2a, e). W kilku przypadkach różnice te zostały poparte danymi z analizy wtórnej, a te przypadki omówimy poniżej. Odkryliśmy również drugą klasę parametrów, dla których zaobserwowano podobne tendencje w dwóch ośrodkach, ale nie zaobserwowano żadnych dowodów trendów w pozostałych dwóch ośrodkach (Rysunek 1b; patrz Dodatkowy plik 3, Rysunek S2b, f). Jednak nasza analiza statystyczna (patrz Materiały i metody) wskazuje, że dla tej klasy parametrów ogólne znaczenie różnic N względem J jest niskie, a obserwowane trendy należy traktować z ostrożnością. Jednak w kilku z tych przypadków obserwowane trendy są zgodne z fenotypami występującymi w pierwszej klasie parametrów. Zidentyfikowaliśmy również trzecią, ale małą klasę parametrów, które wykazywały bardzo istotne różnice w dwóch lub więcej ośrodkach (ryc. 2; patrz plik dodatkowy 3, ryc. S2d, h), ale nieoczekiwanie odwrotny trend w jednym z ośrodków. Omawiamy przyczyny tych anomalii, które w niektórych przypadkach przypuszczalnie wynikają z interakcji centrum genów. Ostatnia klasa reprezentuje dużą liczbę testów, w których nie zaobserwowaliśmy żadnych spójnych i znaczących różnic między ośrodkami, dochodząc do wniosku, że są to raczej fałszywie pozytywne wyniki niż dowody na różnice N / J (patrz Dodatkowy plik 3, Rysunek S2c , g).

Dysmorfologia i okulistyka

Nie znaleźliśmy żadnych dowodów na jakiekolwiek istotne różnice w cechach morfologicznych między N i J, w tym badanie rentgenowskie szkieletu. Jednakże zidentyfikowano szereg różnic okulistycznych między dwoma szczepami. Analiza ogólnych funkcji wzroku przy użyciu wirtualnego bębna optokinetycznego wykazała pogorszenie widzenia u myszy N w porównaniu z myszami J (N: 0,314 cykli / stopień, 95% CI 0,305 do 0,323, n = 89; J: 0,399 cykli / stopień, 95% CI 0,394 do 0,404, n = 128; p < 0,001, test t Studenta). Nie odzwierciedlało to różnic w zmętnieniu soczewki, ponieważ analiza ilościowa przy użyciu aparatu Scheimpfluga wykazała przezroczyste soczewki w oba szczepy (N: 5,2 + 0,5%, n = 10; J: 5,0% + 0,5% zmętnienia, n = 10). Białe plamki były widoczne na dnie myszy N z dużą częstotliwością, których nie było u myszy J ( Ryc. 3A) Jest to prawdopodobnie spowodowane obecnością mutacji Crb1rd8 u myszy N, jak opisano wcześniej, chociaż w naszym przypadku plamki były widoczne tylko w brzusznej siatkówce, z różnicami w wielkości plamek i dotkniętym obszarem między myszami (Ryc. 3A) . Dalsze badania z zastosowaniem miejscowej endoskopii dna oka wykazały, że liczba głównych naczyń była zmienna i wahała się od trzech do siedmiu w przypadku żył oraz trzech i eig. ht dla tętnic (ryc. 3B), a dana mysz może mieć niezgodne liczby między oczami. Średnia liczba żył i tętnic była znacznie wyższa (P < 0,001) u myszy J niż u myszy N (ryc. 3C).

Układ sercowo-naczyniowy

Nieinwazyjne pomiary ciśnienia krwi (ESLIM_002) wykazały, że skurczowe ciśnienie tętnicze było znacznie wyższe u myszy J niż u myszy N, chociaż stwierdzono, że znaczenie tego efektu jest różne w zależności od płci i między ośrodkami. Ponadto wszystkie ośrodki zaobserwowały, że częstość tętna była znacznie wyższa u myszy N niż u myszy J.Jednak drugi partner w konsorcjum odkrył, że częstość akcji serca w znieczuleniu była znacznie niższa u myszy N niż u samców myszy J, co znajduje odzwierciedlenie w długich odstępach między uderzeniami (RR) i odstępem QTc. Stwierdziliśmy również, że masa serca znormalizowana do długości piszczeli (ESLIM_020) była znacznie niższa u myszy N niż u myszy J w dwóch ośrodkach i wyniki te zostały niezależnie potwierdzone przez analizę wtórną. Dalsze badania struktury i funkcji serca za pomocą echokardiografii oraz czynności skurczowej serca za pomocą hemodynamiki nie ujawniły żadnych różnic między N i J (dane niepokazane).

Metabolizm

W przypadku pośrednich pomiarów kalorymetrycznych myszy karmionych na wolności (ESLIM_003), znaleźliśmy stałą różnicę między N i J w zużyciu O2, produkcji CO2 i wytwarzaniu ciepła. Myszy J wykazywały zmniejszoną wymianę gazową i mniejszy wydatek energii (wytwarzanie ciepła lub tempo metabolizmu) w porównaniu z N, który był generalnie bardziej zaznaczony u samic. We wtórnym fenotypowaniu z pośrednią kalorymetrią na czczo zaobserwowano tendencję do mniejszego wydatku energetycznego w J w porównaniu z N w porze nocnej. Było to prawdopodobnie związane ze zmniejszoną aktywnością ambulatoryjną w J i mniejszym spożyciem pokarmu w J w porównaniu z N w porze nocnej, zwłaszcza podczas ponownego karmienia (dane nieprzedstawione). Nie było spójnej różnicy w aktywności na ekranie kalorymetrycznym z podawaniem swobodnym (ESLIM_003) w dwóch ośrodkach, w których mierzono aktywność (patrz Dodatkowy plik 3, Rysunek S2c, g). Uproszczone dootrzewnowe testy tolerancji glukozy (IPGTT) (ESLIM_004) wykazały upośledzoną tolerancję glukozy u myszy J versus N. Te obserwacje dotyczące metabolizmu glukozy są zgodne ze znaną delecją genu Nnt specyficznego dla myszy J, który, jak wykazano, odgrywa rolę w regulacji odpowiedzi insulinowej w komórkach beta trzustki.

Podwójna energia X -absorptiometria promieniowa (DEXA) składu ciała i pomiary densytometryczne kości (ESLIM_005) wykazały, że myszy N mają zwiększoną masę tłuszczową (zarówno bezwzględną, jak i znormalizowaną do masy). Ponadto pomiary DEXA wykazały, że myszy J mają zwiększoną masę beztłuszczową w porównaniu z N. W dwóch z ośrodków pomiary gęstości mineralnej kości były wyższe u samców myszy J; Jednak odkrycie to nie zostało powtórzone w trzecim ośrodku, który przeprowadził ekrany DEXA. Przystąpiliśmy do analizy mikroskopowej tomografii komputerowej (μCT) dwóch szczepów (ryc. 4) i stwierdziliśmy, że grubość warstwy korowej, porowatość korowa i objętość kości beleczkowej pozostały niezmienione między N a J. Ponadto, analiza różnych mikroarchitektur parametry wskazywały, że ogólna sieć beleczek była podobna. Wreszcie, pomiar tworzenia kości i markerów resorpcji nie wykazał żadnych różnic między dwoma szczepami (rysunek 4).

Neurologiczne, behawioralne i sensoryczne

Dwa ośrodki wykazali główne i spójne różnice między N i J w aktywności w otwartym polu (ESLIM_007) (Ryc. 2), w tym wyższą aktywność myszy J mierzoną przebytą odległością i większą liczbą wejść środkowych wskazujących na zmniejszony niepokój. Różnice te są zgodne z opublikowanymi ostatnio danymi dotyczącymi porównania behawioralnego N i J. Co ciekawe, najbardziej znaczące efekty ograniczały się do mężczyzn w obu ośrodkach. Nieoczekiwanie w trzecim ośrodku zaobserwowano odwrotność, przy czym myszy N były bardziej aktywne niż J, chociaż te efekty obserwowano zarówno u samców, jak iu samic. Czwarty ośrodek nie wykrył tych efektów, nie stwierdzając żadnych istotnych różnic. Wszystkie ośrodki stosowały do procedury SPO EMPRESSlim, która obejmowała wymóg dotyczący aren o podobnej wielkości, ale istniały pewne różnice operacyjne między ośrodkami, w tym wykorzystanie pojedynczych lub wielu pomieszczeń do przechowywania aren; areny z przezroczystymi lub nieprzezroczystymi bokami; oraz brak lub obecność wzbogacenia środowiskowego w klatkach domowych (o którym wiadomo, że ma wpływ na wyniki behawioralne). Jednak żadna z tych zmiennych nie była zgodna z różnymi obserwacjami między ośrodkami.Nie można jednak wykluczyć wpływu mikrobiomu jelitowego, który może różnić się w zależności od ośrodka. Wiadomo, że mikrobiom jelitowy wpływa na funkcje i zachowanie ośrodkowego układu nerwowego, głównie poprzez oś podwzgórze-przysadka-nadnercza. Dochodzimy do wniosku, że w pewnych warunkach można zauważyć znaczące różnice w parametrach pola otwartego między N i J, ale natura tych różnic jest wrażliwa na nieznane warunki środowiskowe. Interesujące jest to, że główne sprzeczne wyniki dotyczące fenotypów N i J ograniczały się do behawioralnej platformy fenotypowania. Z kolei w przypadku większości innych testów (poza kilkoma parametrami hematologicznymi i chemii klinicznej, patrz poniżej) nie znaleźliśmy niespójności, co wskazuje, że w przeciwieństwie do większości platform fenotypowych, analizy behawioralne mogą być bardzo wrażliwe na parametry środowiskowe.

Przeprowadziliśmy również test przejścia światło / ciemność, aby porównać lęk u szczepów N i J (Rysunek 5). Nie znaleźliśmy znaczących różnic między myszami N i J w liczbie przejść światło-ciemność lub w procentowym czasie spędzonym w ciemnym pomieszczeniu. Jednak opóźnienie wejścia do ciemnego przedziału było znacznie wyższe u myszy N. Zmodyfikowane testy SHIRPA (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phenotype Assessment) (ESLIM_008, ryc. 1a) we wszystkich czterech ośrodkach wykazały, że samce myszy J miały znacznie zwiększoną aktywność lokomotoryczną, co korelowało z odkryciem zwiększonej odległości pokonywanej w testy w terenie w niektórych ośrodkach (patrz powyżej).

Przeprowadziliśmy szereg testów, które odzwierciedlają zdolności motoryczne. Różnice w sile chwytu (ESLIM_009) zaobserwowano we wszystkich ośrodkach, przy czym J było wyższe niż N, ale parametry, na które miały wpływ, były różne, przy czym niektóre ośrodki zgłaszały różnice w sile chwytu przednich kończyn, a niektóre łącznie dla siły chwytu przedniej i tylnej kończyny , b). Testy na rotarod (ESLIM_010) wykazały znaczne różnice w opóźnieniu opadania we wszystkich ośrodkach, chociaż zmniejszoną zdolność motoryczną N obserwowano tylko u kobiet w dwóch ośrodkach. Następnie zbadaliśmy zdolności motoryczne samców myszy N i J, badając zdolność uczenia się motorycznego na rotarod w ciągu 4 dni (Rysunek 5). Podczas gdy sprawność motoryczna myszy J poprawiła się znacznie od dnia 1 do dnia 2, wydajność myszy N poprawiła się tylko stopniowo i była znacząco różna od pomiarów z dnia 1 tylko od dnia 3 (P < 0,05) dalej. Co więcej, od 2 do 4 dnia istniały bardzo istotne różnice w opóźnieniu między N i J.Pierwotne testy przeprowadzone w ośrodkach ujawniły w ten sposób potencjalne zmniejszenie wydajności motorycznej w N, które zostało potwierdzone i dopracowane w bardziej wyrafinowanych badaniach zdolności uczenia się motorycznego.

Przeprowadziliśmy również dwa dodatkowe testy behawioralne, aby dokładniej określić różnice między N a J. Po pierwsze, porównaliśmy wydajność N i J w teście labiryntu wodnego Morrisa używanego do oceny pamięci przestrzennej. Myszy płci męskiej N wykazywały bardzo znacząco zmniejszoną wydajność (większe opóźnienie) w porównaniu z myszami płci męskiej J (Figura 6). Po drugie, zbadaliśmy uczenie się lub pamięć emocjonalną pod kątem zdarzenia awersyjnego, używając wskazówek i testów warunkowania strachu kontekstowego; jednak tutaj nie znaleźliśmy żadnych znaczących różnic między dwoma szczepami (dane nieprzedstawione).

Badanie akustycznego zaskoczenia i hamowania przed impulsem (ESLIM_011) (Rysunek 1a) w tych dwóch szczepach pozwoliło zidentyfikować różnorodne parametry które były znacząco i konsekwentnie różne w różnych ośrodkach. Akustyczna amplituda zaskoczenia przy 110 dB i wielkość reakcji wstrząsu na przedimpuls i impuls (PP1-PP4 + impuls, patrz EMPReSSslim) były zmniejszone w N w porównaniu z J, chociaż efekt ten nie był obserwowany u kobiet w jednym ośrodku. Zgodnie z tymi obserwacjami stwierdziliśmy, że hamowanie przed impulsem różniło się między N i J, przy czym hamowanie przed impulsem w PP2 i PP3 i globalne hamowanie wzrosło w N w porównaniu z J. Kilka innych parametrów wielkości przestrachu i hamowania przed impulsem wykazało znaczący wpływ na jeden lub dwa ośrodki (ryc. 1b; patrz plik dodatkowy 3, ryc. S2b, f), ale nie zaobserwowano żadnych różnic w innych ośrodkach. Obserwacje natężenia zaskoczenia nie były zakłócone przez różnice w słyszeniu, ponieważ ocenialiśmy progi słuchowe zarówno u myszy J, jak i N za pomocą testu odpowiedzi słuchowej pnia mózgu i nie stwierdziliśmy żadnych różnic (dane nieprzedstawione).

Chemia kliniczna

Obszerne panele klinicznych testów chemicznych przeprowadzono na próbkach osocza zebranych na końcu każdego rurociągu fenotypowania. Próbkę krwi na końcu rurociągu 1 (ESLIM_021) pobrano po całonocnym poście, podczas gdy próbka na końcu rurociągu 2 (ESLIM_015) pochodziła od zwierzęcia karmionego na wolności.Dane zgodne z co najmniej trzema ośrodkami wykazały, że mocznik i elektrolity, sód, potas i chlorek były znacznie wyższe w osoczu myszy J w porównaniu z myszami N (Rysunek 1a), chociaż istniały wyraźne interakcje między ośrodkami płciowymi. Dane dotyczące poziomów glukozy w osoczu po jedzeniu na czczo i na czczo wskazywały, że w każdym teście co najmniej dwa ośrodki stwierdziły, że poziomy glukozy w osoczu są wyższe u myszy N niż u myszy J (Rysunek 1b). Jednak wiadomo, że na poziom glukozy we krwi wpływa postępowanie ze zwierzętami, obróbka próbek i stosowanie środków znieczulających. Przedstawione tutaj dane pochodzą z próbek pobranych w znieczuleniu w postaci gazowego izofluoranu, z wyjątkiem jednego ośrodka, w którym próbki pobierano pod zastrzykiem ketaminy / ksylazyny (patrz Rysunek 1). Jak omówiono powyżej, z powodu ich znanego upośledzenia wydzielania insuliny, wydaje się sprzeczne, że myszy J mają niższe poziomy glukozy w osoczu niż myszy N, ale wydaje się, że delecja w Nnt wpływa tylko na klirens glukozy oraz myszy J na czczo lub bez prowokacji nie mają ciągłej hiperglikemii. Wykazano, że kilka innych parametrów było wyższe u myszy J niż u myszy N w co najmniej dwóch ośrodkach, ale w każdym przypadku inny ośrodek (ośrodki) nie zgłosił żadnych istotnych różnic w tych samych parametrach (ryc. 1b), na przykład w przypadku wolnych kwasów tłuszczowych. Dwa ośrodki stwierdziły, że żelazo było znacznie wyższe u samców N i że fosfatazy alkalicznej było znacznie wyższe u samców J. Jeden z tych ośrodków również stwierdził, że to samo dotyczy kobiet (ryc. 2). Jednak dane dla każdego z tych parametrów z trzeciego ośrodka zaprzeczają tym odkryciom.

Hematologia

Różne parametry hematologiczne mierzono pod koniec rurociągu 2 (ESLIM_016). Dwa ośrodki wykryły znaczące zmiany w szeregu parametrów, ale wyniki te nie zostały powtórzone w innych, w tym w liczbie białych i czerwonych krwinek, średniej objętości komórek i średniej hemoglobinie w krwinkach (ryc. 1b). Uzyskano sprzeczne wyniki w badaniach hematokrytu i średniego stężenia hemoglobiny w komórkach (ryc. 2). W każdym przypadku dane z dwóch ośrodków były zgodne, natomiast w trzecim ośrodku efekt był odwrotny. Potencjalnie może to wynikać z różnych technologii maszyn używanych do pomiarów hematologicznych w uczestniczących klinikach, jak odnotowano w metadanych.

Funkcje odpornościowe i alergia

Zbadaliśmy szereg wtórnych fenotypów w tym oporność gospodarza na Listeria monocytogenes w szczepach J i N. Samice obu szczepów były bardziej podatne na infekcję L. monocytogenes; jednakże różnica płci we wrażliwości gospodarza Listeria była mniej wyraźna w N niż w J. Samce szczepu N wykazywały zwiększony klirens Listeria w 4 dniu po zakażeniu w porównaniu z samcami J. Koreluje to ze zwiększoną odpowiedzią prozapalną u samców N w 3 dniu po zakażeniu w porównaniu z samcami J (ryc. 7).

Testowaliśmy również myszy N i J pod kątem nadwrażliwość kontaktowa wywołana dinitrofluorobenzenem (DNFB) (CHS). Zidentyfikowano istotne różnice w odpowiedzi CHS między dwoma szczepami myszy, przy czym J wykazał zwiększoną odpowiedź CHS. Zauważalne, że samice myszy obu szczepów wykazywały zwiększoną wartość CHS w porównaniu z samcami myszy. Badanie odpowiedzi komórek naturalnych zabójców (NK) na różne bodźce wykazało, że większa część komórek NK jest aktywowana przez samą interleukinę (IL) -12 lub w połączeniu z IL-2 w J w porównaniu z myszami N; ponownie ta odpowiedź była bardziej znacząca u kobiet (ryc. 8).