Kiedy w 481 pne rozpoczęła się druga inwazja perska na Grecję, Leonidas został wybrany na dowódcę połączonych sił greckich, zarówno ze względu na reputację Spartan jako przełożonego wojska królestwo i z powodu jego własnej sprawności jako generała. Mówi się, że król odwiedził Wyrocznię w Delfach, z którą konsultowano się w ważnych sprawach państwowych w całej starożytnej Grecji, a Wyrocznia wydała wielki wers, który zasadniczo powiedział mu, że musi oddać życie, aby zapobiec zniszczeniu swojego królestwa przez Persję.
W sierpniu 480 rpne Leonidas wyruszył na spotkanie z armią perskiego króla Kserksesa pod Termopilami, wąskim nadmorskim przejściem leżącym na trasie Persów w głąb lądu. Miał ze sobą zaledwie 300 elitarnych żołnierzy spartańskich i 900 niewolników, do których dodał, maszerując przez inne miasta-państwa, uzyskując łączną armię liczącą od 4000 do 7000 ludzi. Przedstawiono różne wyjaśnienia, dlaczego siła była tak mała; Herodot wysunął teorię, że Spartanie maszerowali prosto, więc widać, że nie okazują strachu, spodziewając się, że zostanie zebrana większa armia i wkrótce potem pójdzie za nią, ale współcześni historycy uważają, że walka wewnętrzna lub nawet fakt, że odbywały się igrzyska olimpijskie w tamtym czasie można było winić za to.
Armia perska, z którą mieli do czynienia, była ogromna. Szacunki Herodota dotyczące dwóch milionów ludzi zostały od tego czasu obalone, ale liczba ta wynosiła co najmniej 70 000, a prawdopodobnie nawet 300 000. Nastąpił czterodniowy pat, a piątego dnia Persowie zaatakowali. Przez dwa dni Grecy powstrzymywali Persów, zabijając około 10 000 ich ludzi, w tym dwóch braci króla Kserksesa. Siódmego dnia zdrajca imieniem Efialtes skontaktował się z perskim generałem Hydarnesem i pokazał mu ukrytą ścieżkę, którą mógł obrać, by dostać się za Greków. Wiedząc, że został oskrzydlony, Leonidas odesłał wszystkie greckie wojska, decydując się pozostać na przełęczy wraz ze swoimi 300 Spartanami i niewolnikami, 400 Tebańczykami i 700 Tespianami.
Herodot odnotował, że Leonidas wysłał mężczyzn do upewnić się, że przeżyją kolejny dzień i będą przydatni w przyszłej bitwie z Persami, a Spartanie zostali, aby chronić Greków przed ucieczką i ponieważ nigdy nie mogli porzucić swojej pozycji na polu bitwy. Podobno Thespianie zostali odesłani razem z innymi Grekami, ale pozostali w tyle z własnej woli.
Podobno Kserkses zaoferował oszczędzenie życia Spartan, jeśli oddadzą broń, na co Leonidas odpowiedział ” ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(przyjdź i zabierz ich). Następnie mężczyźni stoczyli zaciekły ostatni bastion przeciwko Persom i wszyscy zostali zabici z wyjątkiem 400 Tebańczyków, którzy poddali się Persom bez walki. Po śmierci Leonidasa Spartanie walczyli o odzyskanie jego ciało i zapobiec profanacji go przez Persów. Leonidas miał około 60 lat w chwili jego śmierci, a jego następcą został jego syn, Pleistarchus.