Szlak p53: dodatnie i ujemne pętle sprzężenia zwrotnego

W różnych badaniach w literaturze zidentyfikowano 10 dodatnich lub ujemnych pętli sprzężenia zwrotnego w szlaku p53 (patrz rysunki 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10). Każda z tych pętli tworzy obwód złożony z białek, na których aktywność lub szybkość syntezy wpływa aktywacja p53, a to z kolei powoduje zmianę aktywności p53 w komórce. Spośród nich siedem to pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego, które modulują aktywność p53 (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyklina G, Wip-1 i Siah-1), a trzy to pętle dodatniego sprzężenia zwrotnego (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF i Rb), które modulują aktywność p53. Wszystkie te sieci lub obwody są autoregulacyjne w tym sensie, że są indukowane przez aktywność p53 na poziomie transkrypcji, ulegają represji transkrypcyjnej przez p53 (p14 / 19 ARF, fig. 3) lub są regulowane przez białka indukowane p53. Sześć z tych pętli sprzężenia zwrotnego działa poprzez MDM-2 (MDM-2, cyklina G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT i Rb), modulując aktywność p53.

Ekscytujące odkrycie jest takie, że szlak p53 jest ściśle powiązany z innym transdukcją sygnału szlaków, które odgrywają znaczącą rolę w początkach raka. Jedno z pierwszych zbadanych połączeń dotyczy p14 / p19ARF i MDM-2. Białko p14 / 19 ARF wiąże się z białkiem MDM-2 i moduluje jego aktywność ligazy ubikwityny, zwiększając poziom białka p53 (Honda i Yasuda, 1999) (Fig. 3). Transkrypcja genu ARF p14 / 19 jest regulowana pozytywnie przez E2F-1 (Zhu i wsp., 1999) i beta-kateninę (Damalas i wsp., 2001) oraz negatywnie regulowana przez sam p53. Ponadto poziomy białka p14 / 19 ARF są zwiększone przez aktywność Ras i Myc w komórce (Figura 3). Złożoność regulacji p53 przez p14 / p19 ARF została ostatnio zweryfikowana (Lowe i Sherr, 2003). Kompleksy p14 / 19 ARF-MDM-2 są często zlokalizowane w jąderku komórki ze względu na sygnały lokalizacji jąderkowej obecne w ARF p14 / p19. Jąderko jest miejscem biogenezy rybosomów, a sama aktywność ARF p14 / 19 może zmieniać szybkość przetwarzania RNA prekursora rybosomalnego RNA w dojrzałe podjednostki rybosomalne (Sugimoto i wsp., 2003). Zatem p14 / 19 ARF poprzez kontrolowanie poziomów MDM-2 i p53 i koordynowanie tego z biogenezą rybosomów odgrywa ważną rolę w regulacji cyklu komórkowego. Zostało to ostatnio wzmocnione przez wykazanie, że białko p14 / 19 ARF może również regulować aktywność Myc (a tym samym wielkość komórek) (Datta i wsp., 2004). MDM-2 w jąderku nie jest jednak bytem pasywnym. Wykazano, że białko MDM-2 wiąże się specyficznie z trzema dużymi białkami podjednostki rybosomalnej L5, L11 i L23 (Marechal i wsp., 1994; Lohrum i wsp., 2003; Zhang i wsp., 2003; Dai i wsp., 2004 ), a wiązanie L5 (Dai i Lu, 2004) lub L11 (Lohrum i wsp., 2003; Zhang i wsp., 2003) do MDM-2 obniża jego aktywność ligazy ubikwityny. Ponadto domena palca serdecznego MDM-2 wiąże się specyficznie z sekwencją RNA znajdującą się w dużej podjednostce rybosomalnego RNA (Elenbaas i wsp., 1996). Chociaż wszystkie te obserwacje wskazują na centralną rolę MDM-2 i p14 / 19 ARF w regulacji biogenezy rybosomów i cyklu komórkowego, nie rozumiemy, w jaki sposób te obserwacje łączą się, tworząc tę regulacyjną pętlę.

Białko Rb można znaleźć w komórkach w kompleksie z MDM-2 i p53, co skutkuje wysoką aktywnością p53 i zwiększoną aktywnością apoptotyczną (Xiao i wsp., 1995). Wysoki poziom aktywnego E2F-1 niezwiązanego z Rb przełącza odpowiedź p53 z zatrzymania G-1 na apoptozę. Zarówno Rb, jak i MDM-2 są fosforylowane i hamowane przez cyklinę E-cdk2 (Figura 4). Kiedy p53 jest aktywowany, stymuluje syntezę białka p21, które hamuje aktywność cykliny E-cdk2, a to z kolei działa na kompleks Rb-MDM-2, który promuje aktywność p53 i apoptozę. Po uszkodzeniu DNA, zarówno białko MDM-2, jak i białko p53 są modyfikowane przez kinazę białkową ATM (Figura 4). Zwiększa to aktywność p53 w taki sam sposób, w jaki kompleks p53-MDM-2-Rb zwiększa funkcję p53 i jest proapoptotyczny. Aby zapoznać się ze szczegółowym, niedawnym przeglądem osi p53-Rb-E2F1, patrz Yamasaki (2003).

Część aktywacji białka p53 obejmuje fosforylację białka p53 w serynach znajdujących się w resztach 33 i 46 przez kinaza p38 MAP (fig. 5). Ta kinaza p38 MAP jest sama aktywowana przez fosforylację (regulowaną przez szlak Ras-Raf-Mek-Erk), która może zostać odwrócona lub inaktywowana przez fosfatazę Wip-1. Wip-1 jest genem reagującym na p53 lub regulowanym przez p53, tworzącym ujemną pętlę autoregulacyjną i łączącym szlaki p53 i Ras (Takekawa i wsp., 2000) (Figura 5). Aktywowane białko p53 pozytywnie reguluje transkrypcję ligazy ubikwityny Siah-1 (Fiucci i wsp., 2004), która z kolei działa w celu degradacji białka beta-kateniny (Iwai i wsp., 2004) (Rysunek 6). Poziomy beta-kateniny mogą regulować gen p14 / 19 ARF, który z kolei negatywnie reguluje MDM-2 i skutkuje wyższymi poziomami p53 (pętla dodatniego sprzężenia zwrotnego) (Rysunek 6). Siah-1 łączy zatem szlak Wnt-beta-katenina-APC ze szlakiem p53. W niektórych typach komórek białko p53 indukuje transkrypcję genu PTEN (Rysunek 7). Białko PTEN jest fosfatazą PIP-3. PIP-3 aktywuje kinazę AKT, która zawiera szereg antyapoptotycznych substratów białkowych, w tym białko MDM-2. Fosforylacja powoduje translokację MDM-2 do jądra, gdzie inaktywuje p53 (Figura 7). To łączy szlak p53 ze szlakiem IGF-1-AKT i tworzy pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego dla zwiększonej aktywności p53 i zmniejszonej aktywności AKT. Ta pętla regulacji p53 również została niedawno omówiona (Gottlieb i wsp., 2002). Te dodatnie i ujemne pętle sprzężenia zwrotnego realizują dwie rzeczy: (1) modulują aktywność p53 w komórce i (2) koordynują aktywność p53 z innymi szlakami transdukcji sygnału, które regulują wejście komórki w cykl komórkowy (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-katenina, IGF-1 i cyklina E-cdk2).

Istnieją dwa dodatkowe obwody autoregulacyjne p53, które negatywnie wpływają na działanie p53. Jednym z najbardziej aktywnych genów reagujących na p53 jest gen cykliny G. Jest szybko transkrybowany do wysokich poziomów po aktywacji p53 w wielu różnych typach komórek (Okamoto i Beach, 1994; Zauberman i wsp., 1995; Bates i wsp., 1996; Yardley i wsp., 1998). Białko cyklina G tworzy kompleks z fosfatazą PP2A, która usuwa resztę fosforanową z MDM-2 (Okamoto i wsp., 2002) (Rysunek 8), która jest dodawana do białka MDM-2 przez kinazę cdk (Zhang i Prives, 2001) (ryc.4). Fosforylacja MDM-2 przez cyklinę A / cdk2 hamuje jej aktywność, a zatem fosfataza cykliny G-PP2A zwiększa aktywność MDM-2 i hamuje p53. Myszy z wyłączonym genem cykliny G są zdolne do życia (Kimura i wsp., 2001), a fibroblasty zarodków myszy zerowej cykliny G mają podwyższone poziomy białka p53 przy braku stresu (Okamoto i wsp., 2002), co pokazuje, że ta pętla sprzężenia zwrotnego działa in vivo i działa na podstawowe poziomy p53 w komórce, nie tylko na wyższe poziomy aktywowane p53 po stresie. Druga pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego obejmuje członka rodziny czynników transkrypcyjnych p53, do których należą p53, p63 i p73, które są powiązane strukturą i funkcją i wyewoluowały ze wspólnego prekursora. Po odpowiedzi stresowej aktywowany jest gen p53, który z kolei stymuluje transkrypcję określonego złożonego m-RNA z genu p73, zwanego p73 delta N (Rysunek 9). To tłumaczy białko p73 bez domeny na końcu aminowym. Wszystkie trzy białka z rodziny p53 mają podobne struktury domen złożone z N-końcowej domeny aktywacji transkrypcji połączonej z centralną domeną rdzeniową, która wiąże się z określoną sekwencją DNA omówioną powyżej. Wszystkie trzy czynniki transkrypcyjne z rodziny p53 rozpoznają tę samą sekwencję DNA, mimo że p53, p63 i p73 są zdolne do inicjowania odrębnych programów transkrypcyjnych. Istnieje jednak duża liczba wspólnych genów, które mogą być regulowane przez wszystkie trzy białka, co ostatnio omówiono w Harms i in. (2004).Tak więc, gdy p53 aktywuje transkrypcję p73 delta N, białko p73 delta N może wiązać się z wieloma genami regulowanymi przez p53, ale brak domeny transaktywacyjnej powoduje, że działa jako represor lub konkurent aktywacji transkrypcji p53. W ten sposób powstaje pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego i spada aktywność p53 (Grob i in., 2001; Kartasheva i in., 2002) (Ryc. 9). Zatem pięć z tych obwodów dodatniego lub ujemnego sprzężenia zwrotnego (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) obejmuje geny i białka, które są głównymi członkami innych szlaków transdukcji sygnału, podczas gdy dwa (cyklina G i p73 delta N) tworzą bezpośrednie pętle negatywnego sprzężenia zwrotnego.

Ostatnie pętle negatywnego sprzężenia zwrotnego, które zostaną omówione, mają postać ligaz ubikwityny. Nieoczekiwanie wydaje się, że istnieją trzy różne aktywności ligazy p53-ubikutyny (MDM-2, Cop-1 i Pirh-1), z których każda tworzy pętlę autoregulacyjną skutkującą niższą aktywnością p53 (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (rysunek 10). Każdy gen jest aktywowany transkrypcyjnie przez p53. Nie jest obecnie jasne, dlaczego istnieje taki poziom nadmiarowości. Istnieje kilka możliwości, że te produkty genów ulegają ekspresji lub działają optymalnie w różnych typach komórek lub tkanek, a nawet na różnych etapach rozwoju. Na przykład mysz z nokautem MDM-2 jest śmiertelna około 6 dni po zapłodnieniu, zaraz po wszczepieniu blastocysty. Może to być wywołane niedotlenieniem, które musi wystąpić na tym etapie, aktywując p53 przy braku MDM-2 i powodując apoptozę. Zgodne z tą interpretacją jest obserwacja, że mysz z podwójnym nokautem p53, MDM-2 jest żywotna i rodzi się tak samo jak mysz z nokautem p53 (Jones i wsp., 1995; Montes de Oca Luna i wsp., 1995). Jest to zatem zgodne z ideą, że białko MDM-2 działa bez dodatkowej aktywności ligazy ubikwityny na etapie blastocysty, ale te inne białka mogą pozwolić na bardziej normalne funkcjonowanie na późniejszych etapach rozwoju. Te pomysły można teraz przetestować. Możliwe jest również, że jedna lub więcej z tych trzech ligaz ubikwityny bierze udział w utrzymywaniu poziomów p53 w stanie niestresowanym lub podstawowym, podczas gdy inne działają dopiero po wytworzeniu p53 wywołanego stresem. Aktywowane białka p53 i indukowane stresem białka p53 mają bardzo różne modyfikacje białek i wpływ tego na aktywność MDM-2, Cop-1 lub Pirh-2 jest obecnie niejasny. Wydaje się prawdopodobne, że każda z tych trzech ligaz ubikwitynowych tworzy kompleksy białkowe w komórce, a powiązane białka mogą się różnić w przypadku każdej z tych ligaz, łącząc je z różnymi obwodami regulatorowymi. Obecnie wiele wiadomo o MDM-2 i stosunkowo mało uwagi poświęcono roli Cop-1 i Pirh-2, o których doniesiono w literaturze dopiero w ciągu ostatniego roku. Dodatkowo, niedawno wykazano, że p53 jest substratem jeszcze jednego enzymu ligazy ubikwityny E3, toporów (Rajendra i wsp., 2004). Pozostaje do ustalenia, czy topory są również celem transkrypcji p53, a zatem powinny zostać dodane do rosnącej listy białek przyczyniających się do autoregulacyjnej kontroli szlaku p53. Kolejnych kilka lat badań powinno odpowiedzieć na te pytania.

Jak wspomniano powyżej, wiele pętli regulacyjnych obejmuje MDM-2, podkreślając tym samym centralną rolę MDM-2 w kontroli aktywności p53. Analiza genetyczna mutacji p53 i MDM-2, które blokują ten kompleks białek, zidentyfikowała krytyczne reszty aminokwasowe w każdym białku, które są ważne dla tej interakcji wiązania (Lin i wsp., 1994; Freedman i wsp., 1997). Wykazano, że te same reszty aminokwasowe powodują te kontakty białek w strukturze krystalicznej końca aminowego HDM-2 (białka ludzkiego) i peptydu z końca aminowego p53 (Kussie i wsp., 1996) . Pozostałości fenyloalaniny 19, tryptofanu 23 i leucyny 26 z p53 tworzą główne kontakty w hydrofobowej kieszeni MDM-2. Fosforylacja reszt seryny 20 i prawdopodobnie seryny 15 powinna osłabić te kontakty, a peptydy i leki, które konkurują z tymi kontaktami, blokują kompleks p53 MDM-2 i promują apoptozę w komórkach (Klein i Vassilev, 2004). Tak więc kompleks p53-MDM-2 i aktywność ligazy ubikwityny MDM-2 stały się głównym celem leków w przypadku niektórych nowotworów. W około jednej trzeciej mięsaków u ludzi oraz w niektórych białaczkach i glejakach gen HDM-2 uległ amplifikacji i białko to ulega nadekspresji. Gen p53 jest typu dzikiego, a białko p53 jest najwyraźniej nieaktywne, więc leki, które niszczą kompleks p53-HDM-2, powinny aktywować p53. Ponadto wydaje się, że wiele innych nowotworów wykazuje ekspresję produktu genu HDM-2 na wysokim poziomie, nawet jeśli gen HDM-2 nie jest amplifikowany. W tych typach nowotworów blokowanie aktywności HDM-2 lub uwalnianie p53 z tego kompleksu może dobrze indukować selektywną apoptozę w komórkach rakowych. Może to również zwiększyć aktywność chemioterapeutyczną niektórych leków aktywujących p53.

Przewiduje się, że pętla autoregulacyjna p53-MDM-2 utworzy oscylator z poziomami p53 i MDM-2 rosnącymi i malejącymi w czasie i poza fazą w komórce. Zostało to najpierw zademonstrowane przez pomiar poziomów MDM-2 i p53 przy użyciu Western blot białek z komórek w hodowli poddanych odpowiedzi stresowej p53 (Lev Bar-Or i wsp., 2000). Podczas gdy oscylacje są obserwowane i tłumione z upływem czasu, to doświadczenie uśrednia stężenia białek z wielu komórek w hodowli, które mogą być poza fazą w swoich oscylacjach, powodując konstruktywne lub destrukcyjne zakłócenia. Z tego powodu znakowane fluorescencyjnie białka fuzyjne p53 i HDM2 były obrazowane w poszczególnych komórkach, aby śledzić zmiany w poziomach p53 i HDM-2 w komórkach przechodzących reakcję stresową p53. Zaobserwowano oczekiwane oscylacje poza fazą i, co zaskakujące, liczba oscylacji w komórce była proporcjonalna do dawki promieniowania podanego tym komórkom (Lahav et al., 2004). Sugeruje to, że p53 może mierzyć natężenie sygnału stresu w sposób cyfrowy (liczba oscylacji), a nie w sposób analogowy (wyższe stężenia p53). Podobne oscylacje zaobserwowano w innych szlakach transdukcji sygnałów, które mają ujemne pętle autoregulacyjne, takich jak szlak NF-κ-B z białkami NF-κ-B i I-κ-B (Scott i wsp., 1993). Te sygnały cyfrowe wynikające z oscylacji ilości czynników transkrypcyjnych mogą równie dobrze skutkować wzorem okresowej ekspresji genów. Jednak sposób, w jaki sygnały cyfrowe na poziomie czynnika transkrypcyjnego są przekształcane na sygnały analogowe na poziomie ilości mRNA wytwarzanego przez gen, pozostaje niejasny. Eksperymenty te prowadzą do możliwości, że różne liczby oscylacji, czas lub długość fali oscylacji lub amplituda tych oscylacji mogą wpływać na wybrany wzór ekspresji genów i wynik (zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptoza lub starzenie) p53. odpowiedzi.

Dlaczego na ścieżce p53 jest tak wiele pętli sprzężenia zwrotnego? Odpowiedzi na to pytanie jest wiele. Nie wszystkie mechanizmy mogą być aktywne w tym samym typie komórki lub tkanki lub na tych samych etapach rozwoju. Pętle sprzężenia zwrotnego typu opisanego tutaj zapewniają środki do łączenia szlaku p53 z innymi szlakami transdukcji sygnału i koordynowania sygnałów komórkowych w celu wzrostu i podziału. Nadmiarowość w systemie może czasami zapobiegać błędom, a system zapasowy zmniejsza fenotyp mutacji. Z drugiej strony, nie każda z pętli sprzężenia zwrotnego pokazana na rysunkach 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 może wytrzymać próbę czasu i dalsze eksperymenty. Wiele z tych szlaków zostało wyjaśnionych na podstawie eksperymentów przeprowadzonych na hodowlach komórek rakowych, które mają mutacje zmieniające te szlaki. Nawet normalne komórki w hodowli lub myszy knockout (ze względu na przystosowanie do mutacji) mogą nie odzwierciedlać wszystkich warunków, które występują w normalnych komórkach i narządach in vivo. Szczególnie trudno jest udowodnić, że specyficzna kinaza białkowa lub fosfataza działa na określony substrat in vivo i daje wynik, który można zmierzyć ilościowo. Dlatego musimy nadal testować i kwestionować funkcje i ścieżki, które naszym zdaniem działają w komórce. Jednak konstrukty te, pokazane na ryc. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10, są przydatne w formułowaniu hipotez i testowaniu pomysłów, które z pewnością doprowadzą do nowych wglądów w naturę nowotworów i projektowanie leków oraz środki, które wybiórczo zabijają komórki rakowe.