p53-vägen: positiva och negativa återkopplingsslingor

En mängd olika studier i litteraturen har identifierat 10 positiva eller negativa återkopplingsslingor i p53-vägen (se figurerna 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 10). Var och en av dessa slingor skapar en krets sammansatt av proteiner vars aktiviteter eller synteshastigheter påverkas av aktiveringen av p53, och detta i sin tur resulterar i förändring av p53-aktivitet i en cell. Av dessa är sju negativa återkopplingsslingor som modulerar ned p53-aktivitet (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyklin G, Wip-1 och Siah-1) och tre är positiva återkopplingsslingor (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF och Rb) som modulerar upp p53-aktivitet. Alla dessa nätverk eller kretsar är autoregulatoriska genom att de antingen induceras av p53-aktivitet på transkriptionsnivå, transkriptionellt undertrycks av p53 (p14 / 19 ARF, figur 3) eller regleras av p53-inducerade proteiner. Sex av dessa återkopplingsslingor fungerar genom MDM-2 (MDM-2, cyclin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT och Rb) för att modulera p53-aktivitet.

Ett spännande resultat är att p53-vägen är intimt kopplad till annan signaltransduktion vägar som spelar en viktig roll i ursprunget till cancer. En av de första anslutningarna som studerats involverar p14 / p19ARF och MDM-2. P14 / 19 ARF-proteinet binder till MDM-2-proteinet och modulerar ner dess ubikvitinligasaktivitet, vilket ökar nivåerna av p53-proteinet (Honda och Yasuda, 1999) (Figur 3). Transkriptionen av p14 / 19 ARF-genen regleras positivt av E2F-1 (Zhu et al., 1999) och beta-catenin (Damalas et al., 2001) och regleras negativt av p53 själv. Dessutom ökar nivåerna av p14 / 19 ARF-protein med Ras- och Myc-aktiviteter i en cell (figur 3). Komplexiteten i regleringen av p53 av p14 / p19 ARF har nyligen granskats (Lowe och Sherr, 2003). P14 / 19 ARF-MDM-2-komplexen är ofta lokaliserade i cellens kärna på grund av de nukleolära lokaliseringssignaler som finns i p14 / p19 ARF. Nukleolus är platsen för ribosomal biogenes och p14 / 19 ARF-aktivitet i sig kan förändra hastigheten för RNA-bearbetning av ribosomalt RNA-föregångaren till mogna ribosomala underenheter (Sugimoto et al., 2003). Således spelar p14 / 19 ARF genom att kontrollera MDM-2- och p53-nivåer och samordna detta med ribosomal biogenes en viktig roll i cellcykelreglering. Detta har nyligen förstärkts av demonstrationen att p14 / 19 ARF-proteinet också kan reglera Myc-aktivitet (och därmed cellstorlek) (Datta et al., 2004). MDM-2 i kärnan är dock inte en passiv enhet. MDM-2-proteinet har visats binda specifikt till tre stora ribosomala subenhetsproteiner L5, L11 och L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), och bindningen av L5 (Dai och Lu, 2004) eller L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) till MDM-2 sänker dess ubiquitinligasaktivitet. Dessutom binder ringfingerdomänen för MDM-2 specifikt till en RNA-sekvens som finns i den stora ribosomala RNA-underenheten (Elenbaas et al., 1996). Även om alla dessa observationer pekar på en central roll för MDM-2 och p14 / 19 ARF vid reglering av ribosombiogenes och cellcykeln, förstår vi inte hur dessa observationer samlas för att bilda denna regleringsslinga.

Rb-proteinet kan hittas i celler i ett komplex med MDM-2 och p53, vilket resulterar i hög p53-aktivitet och förbättrad apoptotisk aktivitet (Xiao et al., 1995). Höga nivåer av aktiv E2F-1 som inte är bunden till Rb växlar p53-svaret från G-1-stopp till apoptos. Både Rb och MDM-2 fosforyleras och inhiberas av cyklin E-cdk2 (figur 4). När p53 aktiveras stimulerar det syntesen av p21-proteinet, vilket hämmar cyklin E-cdk2-aktivitet, och detta i sin tur verkar på Rb-MDM-2-komplexet som främjar p53-aktivitet och apoptos. Efter DNA-skada modifieras både MDM-2-proteinet och p53-proteinet av ATM-proteinkinaset (figur 4). Detta förbättrar p53-aktivitet på samma sätt som p53-MDM-2-Rb-komplexet ökar p53-funktionen och är proapoptotisk. För en detaljerad nyligen granskning av p53-Rb-E2F1-axeln, se Yamasaki (2003).

En del av aktiveringen av p53-proteinet innefattar fosforylering av p53-proteinet vid seriner belägna vid resterna 33 och 46 av p38 MAP-kinaset (Figur 5). Detta p38 MAP-kinas aktiveras i sig av fosforylering (regleras av Ras-Raf-Mek-Erk-vägen) som kan reverseras eller inaktiveras av Wip-1-fosfataset. Wip-1 är en p53-responsiv eller p53-reglerad gen som bildar en negativ autoregulatorisk slinga och förbinder p53- och Ras-vägarna (Takekawa et al., 2000) (Figur 5). Ett aktiverat p53-protein reglerar positivt transkriptionen av ubiquitinligaset Siah-1 (Fiucci et al., 2004), vilket i sin tur verkar för att bryta ned beta-cateninproteinet (Iwai et al., 2004) (Figur 6). Beta-cateninnivåer kan reglera p14 / 19 ARF-genen, vilket i sin tur negativt reglerar MDM-2 och resulterar i högre p53-nivåer (en positiv återkopplingsslinga) (Figur 6). Siah-1 ansluter således Wnt-beta-catenin-APC-vägen till p53-vägen. I vissa celltyper inducerar p53-proteinet transkriptionen av PTEN-genen (Figur 7). PTEN-proteinet är ett PIP-3-fosfatas. PIP-3 aktiverar AKT-kinaset, som har ett antal antiapoptotiska proteinsubstrat inklusive MDM-2-proteinet. Fosforylering resulterar i translokation av MDM-2 till kärnan där den inaktiverar p53 (figur 7). Detta förbinder p53-vägen med IGF-1-AKT-vägen och bildar en positiv återkopplingsslinga för förbättrad p53-aktivitet och minskad AKT-aktivitet. Denna slinga i p53-reglering har också nyligen granskats (Gottlieb et al., 2002). Dessa positiva och negativa återkopplingsslingor åstadkommer två saker: (1) de modulerar p53-aktivitet i cellen och (2) de samordnar p53-aktivitet med andra signalöverföringsvägar som reglerar cellens inträde i cellcykeln (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenin, IGF-1 och cyclin E-cdk2-aktiviteter).

Det finns ytterligare två p53-autoregulatoriska kretsar som negativt återkopplar p53-funktionen. En av de mest aktiva av de p53-responsiva generna är cyclin G-genen. Det transkriberas snabbt till höga nivåer efter p53-aktivering i en mängd olika celltyper (Okamoto och Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). Cyclin G-proteinet gör ett komplex med PP2A-fosfataset, som avlägsnar en fosfatrest från MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (Figur 8), som tillsätts till MDM-2-proteinet med ett cdk-kinas (Zhang och Prives, 2001) (Figur 4). Fosforylering av MDM-2 med cyklin A / cdk2 hämmar dess aktivitet, sålunda förbättrar cyklin G-PP2A-fosfatas MDM-2-aktivitet och hämmar p53. Möss med utslagen cyclin G-gen är livskraftiga (Kimura et al., 2001), och cyclin G null-musembryofibroblaster har förhöjda p53-proteinnivåer i frånvaro av stress (Okamoto et al., 2002), vilket visar att denna feedback-loop är operativ in vivo och verkar på basala nivåer av p53 i en cell, inte bara de högre p53 aktiverade nivåerna efter stress. Den andra negativa återkopplingsslingan involverar en medlem av p53-familjen av transkriptionsfaktorer, som inkluderar p53, p63 och p73 som är relaterade av struktur och funktion och har utvecklats från en gemensam föregångare. Efter ett stressrespons aktiveras p53-genen, vilket i sin tur stimulerar transkriptionen av ett speciellt skarvat m-RNA från p73-genen, kallat p73 delta N (figur 9). Detta översätter ett p73-protein utan dess aminoterminala domän. Alla tre av p53-familjen av proteiner har liknande domänstrukturer som består av en N-terminal transkriptionsaktiveringsdomän kopplad till en central kärndomän som binder till en specifik DNA-sekvens som diskuterats ovan. Alla tre av p53-familjens transkriptionsfaktorer känner igen samma DNA-sekvens, även om p53, p63 och p73 kan initiera distinkta transkriptionsprogram. Det finns emellertid ett stort antal vanliga gener som kan regleras av alla tre proteinerna som nyligen granskats i Harms et al. (2004).Således, när p53 aktiverar transkriptionen av p73 delta N, kan p73 delta N-proteinet binda till många av de p53-reglerade generna, men frånvaron av en transaktiveringsdomän får det att fungera som en repressor eller konkurrent till p53-transkriptionsaktivering. På detta sätt sätts en negativ återkopplingsslinga in och p53-aktivitet minskar (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (Figur 9). Således involverar fem av dessa positiva eller negativa återkopplingskretsar (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) gener och proteiner som är centrala medlemmar i andra signaltransduktionsvägar, medan två (cyklin G och p73 delta N) bilda direkta negativa återkopplingsslingor.

De slutliga negativa återkopplingsslingorna som ska diskuteras kommer i form av ubikitinligaser. Överraskande tycks det finnas tre olika p53-ubiqutin-ligasaktiviteter (MDM-2, Cop-1 och Pirh-1), var och en bildar en autoregulatorisk slinga som resulterar i lägre p53-aktivitet (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (Figur 10). Varje gen aktiveras transkriptionellt av p53. Bara varför det finns denna nivå av redundans är för närvarande oklart. Flera möjligheter är att dessa genprodukter uttrycks eller verkar optimalt i olika cell- eller vävnadstyper eller till och med vid olika utvecklingsstadier. Exempelvis är MDM-2 knockout-musen dödlig ungefär 6 dagar efter befruktning precis vid implantation av blastocysten. Detta kan utlösas av hypoxi som måste uppstå i det skedet, aktiverar p53 i frånvaro av MDM-2 och orsakar apoptos. I överensstämmelse med denna tolkning är iakttagelsen att en p53, MDM-2 dubbel knockout-mus är livskraftig och föds lika normalt som en p53 knockout-mus (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Detta överensstämmer därför med tanken att MDM-2-proteinet verkar utan en backup-ubiquitinligasaktivitet i blastocyststadiet, men dessa andra proteiner kan tillåta en mer normal funktion vid senare utvecklingsstadier. Dessa idéer är nu testbara. Det är också möjligt att en eller flera av dessa tre ubikvitinligaser är involverade i upprätthållandet av p53-nivåer i icke-sträckt eller basalt tillstånd, medan andra endast verkar efter att en stressinducerad p53 produceras. De aktiverade p53 och de stressinducerade p53-proteinerna har mycket olika proteinmodifieringar och effekten av detta på aktiviteten av MDM-2, Cop-1 eller Pirh-2 är för närvarande oklar. Det förefaller troligt att var och en av dessa tre ubikvitinligaser bildar proteinkomplex i cellen och de associerade proteinerna kan mycket väl skilja sig åt för var och en av dessa ligaser och koppla dem till olika reglerande kretsar. För närvarande är mycket känt om MDM-2 och relativt lite fokus har lagts på rollen som Cop-1 och Pirh-2, som bara har rapporterats i litteraturen under det senaste året eller så. Dessutom har p53 nyligen visat sig vara substratet för ännu ett E3-ubikitinligasenzym, toporer (Rajendra et al., 2004). Det återstår att avgöra om toporer också är ett transkriptionellt mål för p53, och därför bör läggas till den växande listan över proteiner som bidrar till autoregulatorisk kontroll av p53-vägen. De närmaste åren av studien bör ta itu med dessa frågor.

Som nämnts ovan involverar många av de reglerande slingorna MDM-2, vilket lyfter fram MDM-2s centrala roll i kontrollen av p53-aktivitet. En genetisk analys av p53- och MDM-2-mutationer som blockerar detta proteinkomplex har identifierat kritiska aminosyrarester i varje protein som är viktiga för denna bindande interaktion (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Samma aminosyrarester har visat sig göra dessa proteinkontakter i kristallstrukturen hos aminoterminalen av HDM-2 (det humana proteinet) och en peptid från aminoterminusen av p53 (Kussie et al., 1996) . Resterna fenyalanin 19, tryptofan 23 och leucin 26 i p53 bildar de viktigaste kontakterna i MDM-2 hydrofoba ficka. Fosforylering av resterna serin 20 och eventuellt serin 15 bör försvaga dessa kontakter, och peptider och läkemedel som konkurrerar med dessa kontakter blockerar p53 MDM-2-komplexet och främjar apoptos i celler (Klein och Vassilev, 2004). Således har p53-MDM-2-komplexet och MDM-2-ubikitinligasaktiviteten blivit ett stort läkemedelsmål för vissa cancerformer. I ungefär en tredjedel av humana sarkomer och i vissa leukemier och glioblastom har HDM-2-genen amplifierats och detta protein är överuttryckt. P53-genen är vildtyp och p53-proteinet är uppenbarligen inaktivt, så att läkemedel som bryter p53-HDM-2-komplexet bör aktivera p53. Dessutom verkar många andra cancerformer uttrycka HDM-2-genprodukten vid höga nivåer även när HDM-2-genen inte amplifieras. I dessa typer av cancer kan blockering av HDM-2-aktivitet eller frigörande av p53 från detta komplex mycket väl inducera apoptos selektivt i cancercellerna. Detta kan också förbättra kemoterapeutisk aktivitet hos vissa läkemedel som aktiverar p53.

Autoregulatorisk slinga för p53-MDM-2 förutses skapa en oscillator med p53- och MDM-2-nivåer som ökar och minskar med tiden och ur fasen i cellen. Detta har visats först genom att mäta MDM-2- och p53-nivåer med användning av Western-blotting av proteiner från celler i kultur som genomgår ett p53-stresssvar (Lev Bar-Or et al., 2000). Medan svängningar observeras och dämpas med tiden, genomsnittar detta experiment proteinkoncentrationerna från många celler i kultur som kan vara ur fas i deras svängningar, vilket ger upphov till konstruktiv eller destruktiv störning. Av denna anledning avbildades fluorescensmärkta p53- och HDM2-fusionsproteiner i enskilda celler för att följa förändringarna i p53- och HDM-2-nivåer i celler som genomgår ett p53-stresssvar. De förväntade svängningarna ur fas observerades och överraskande var antalet svängningar i en cell proportionell mot strålningsdosen som gavs till dessa celler (Lahav et al., 2004). Detta antyder att p53 kan mäta intensiteten hos en stressignal på ett digitalt sätt (antal svängningar) och inte på ett analogt sätt (högre p53-koncentrationer). Liknande oscillationer har observerats i andra signalöverföringsvägar som har negativa autoregulatoriska slingor, såsom NF-k-B-vägen med NF-k-B- och I-k-B-proteinerna (Scott et al., 1993). Dessa digitala signaler som härrör från svängningar i mängden transkriptionsfaktorer kan mycket väl resultera i ett mönster av periodiskt genuttryck. Hur digitala signaler på transkriptionsfaktornivå översätts till analoga signaler på mängden mRNA som produceras av en gen är dock fortfarande oklart. Dessa experiment leder till möjligheten att olika antal svängningar, tidpunkten eller våglängden för svängningarna eller amplituden av dessa svängningar kan påverka det valda mönstret för genuttryck och resultatet (cellcykelstopp, apoptos eller åldrande) av p53 svar.

Varför finns det så många återkopplingsslingor i p53-vägen? Det finns många svar på denna fråga. Alla mekanismer kanske inte är aktiva i samma cell eller vävnadstyp eller i samma stadier under utvecklingen. Återkopplingsslingor av den typ som beskrivs här tillhandahåller ett sätt att ansluta p53-vägen med andra signalöverföringsvägar och koordinera de cellulära signalerna för tillväxt och delning. Uppsägningar i ett system kan ibland förhindra fel och ett reservsystem minskar fenotypen av mutationer. Å andra sidan kan inte var och en av återkopplingsslingorna som visas i figurerna 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 10 klara tidens test och ytterligare experiment. Många av dessa vägar har belysts genom experiment utförda med cancerceller i kultur som har mutationer som förändrar dessa vägar. Även normala celler i odling eller knockout-möss (på grund av anpassning till mutationen) speglar kanske inte alla förhållanden som förekommer i normala celler och organ in vivo. Det är särskilt svårt att bevisa att ett specifikt proteinkinas eller fosfatas verkar på ett specifikt substrat in vivo och har ett resultat som kan mätas kvantitativt. Således måste vi fortsätta att testa och utmana de funktioner och vägar vi tror fungerar i en cell. Dessa konstruktioner, visade i figurerna 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 10, är dock användbara för att formulera hypoteser och testa idéer som säkert kommer att leda till nya insikter om cancerens natur och utformningen av läkemedel och medel som selektivt dödar cancerceller.