Als die zweite persische Invasion in Griechenland 481 v. Chr. Begann, wurde Leonidas ausgewählt, um die kombinierten griechischen Streitkräfte zu führen, beide wegen des Rufs der Spartaner als überlegenes Militär Königreich, und wegen seiner eigenen Fähigkeiten als General. Es wird gesagt, dass der König das Orakel in Delphi besuchte, das zu wichtigen Staatsangelegenheiten im gesamten antiken Griechenland konsultiert wurde, und das Orakel einen großen Vers lieferte, der ihm im Wesentlichen sagte, dass er sein Leben niederlegen muss, um zu verhindern, dass sein Königreich verwüstet wird von Persien.
Im August 480 v. Chr. marschierte Leonidas aus, um die Armee des persischen Königs Xerxes in Thermopylae zu treffen, einer engen Küstenpassage, die auf der Route der Perser im Landesinneren lag. Er hatte nur 300 spartanische Elitesoldaten und 900 Sklaven bei sich, die er hinzufügte, als er quer durchs Land durch andere Stadtstaaten marschierte und eine Gesamtarmee von 4.000 bis 7.000 Mann hatte. Es wurden verschiedene Erklärungen abgegeben, warum die Truppe so klein war; Herodot vermutete, dass die Spartaner direkt ausmarschierten, so dass sie keine Angst zeigten, mit der Erwartung, dass eine größere Armee zusammengestellt werden und bald darauf folgen würde, aber moderne Historiker glauben an interne Konflikte oder sogar an die Tatsache, dass die Olympischen Spiele stattfanden zu der Zeit könnte schuld gewesen sein.
Die persische Armee, mit der sie konfrontiert waren, war zahlreich. Herodots Schätzung von zwei Millionen Männern wurde inzwischen entlarvt, aber die Zahl betrug mindestens 70.000 und möglicherweise bis zu 300.000. Eine viertägige Pattsituation folgte, dann griffen die Perser am fünften Tag an. Zwei Tage lang hielten die Griechen die Perser zurück und töteten ungefähr 10.000 ihrer Männer, darunter zwei Brüder von König Xerxes. Am siebten Tag kontaktierte ein Verräter namens Ephialtes den persischen General Hydarnes und zeigte ihm einen verborgenen Weg, den er gehen konnte, um hinter die Griechen zu gelangen. In dem Wissen, dass er jetzt überflügelt war, schickte Leonidas alle griechischen Truppen weg und entschied sich, mit seinen 300 Spartanern und Sklaven, 400 Thebanern und 700 Thespisjüngerinnen im Pass zu bleiben Stellen Sie sicher, dass sie leben, um einen weiteren Tag zu kämpfen und in einem zukünftigen Kampf gegen die Perser nützlich zu sein, und die Spartaner blieben beide, um die Flucht der Griechen zu schützen und weil sie ihre Position auf dem Schlachtfeld niemals aufgeben konnten. Die Thespisjünger sollten mit den anderen Griechen weggeschickt worden sein, blieben aber hinter ihrem eigenen Willen zurück.
Xerxes bot angeblich an, den Spartanern das Leben zu ersparen, wenn sie ihre Waffen aufgaben, worauf Leonidas antwortete. “ ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(komm und nimm sie). Die Männer kämpften dann einen erbitterten letzten Kampf gegen die Perser, und alle wurden getötet, mit Ausnahme der 400 Thebaner, die sich kampflos den Persern ergaben. Nachdem Leonidas getötet worden war, kämpften die Spartaner um den Rückzug sein Körper und verhindern, dass die Perser ihn entweihen. Leonidas war zum Zeitpunkt seines Todes ungefähr 60 Jahre alt, und sein Sohn Pleistarchus folgte ihm nach.