Udførelse af Cl2-flowtest sammenlignet med en konventionel dyppetest
Først sammenlignede vi en kommercielt tilgængelig gratis klordypningstest fra Merck med en simpel papirbaseret strømningstest til at undersøge den generelle indflydelse af en kapillærdrevet strømning på testens følsomhed, dvs. for at tage fat på spørgsmålet, om farvestoffets langvarige eksponering for analyten løsning fører til forbedret følsomhed.
Til dette blev en bred pude med SA-blæk trykt på et bomuldsskinnepapir med en længde på 9 cm uden yderligere tilsætningsstoffer. Figur 3 viser, at neddypningen af reaktionszonen på denne papirstrimmel i en 5 ppm chloropløsning fører til en farveintensitet, der kan sammenlignes med den kommercielle diptest. Placering af strømningstest dog kun i en lille mængde analytopløsning, der ikke straks dækker reaktionszonen, men strømmer med kapillarkræfter inden for 7–8 minutter til slutningen af den 9 cm lange papirstrimmel, fører til en klart højere farve intensitet sammenlignet med den kommercielt tilgængelige dip-test. Ved siden af farveintensiteten afhænger bredden af den farvede pude også af klorkoncentrationen. For en bedre læsbarhed er det nyttigt at bruge en kappe omkring papirstrimlen med en blænde, som Bauer et al. 9 antydede, at brugeren fokuserer på farveintensiteten for at fortolke resultaterne. Alternativt er det muligt at udskrive en endnu bredere farvestofpude og bruge en afstandsbaseret detektionsaflæsning17,18,19. Den farvede sektion er imidlertid ikke homogen og falmer mod slutningen, hvilket gør dens længde svært at måle. Udskrivning af separate farvestoflinier i en stregkodestrømningstest20,21,22,23 i stedet for et farvestofsektion letter aflæsningen med øjet, da både farveintensiteten og antallet af linjer kan sammenlignes til semikvantitativ analyse. Figur 3 (nederst) viser scanninger af sådanne stregkodestrømningstest med fem linjer efter kontakt med forskellige kloropløsninger. Igen er strømningstestens farve meget mere intens end den dyppede test. Endelig forbedres opløsning med hensyn til forskellige koncentrationer ved hjælp af stregkodeopsætningen sammenlignet med en simpel flowtest. Derfor antyder disse resultater, at en papirbaseret flowtest fører til en højere følsomhed end en dip-test, og derudover tillader en flowtest mere komplekse trykmønstre, der kan forenkle en semikvantitativ analyse.
Billeder af kommercielle fri klorteststrimler efter 2 sek dypp i fri kloropløsning på 5 til 0,5 ppm i sammenligning med 9 cm lange flowtest og stregkodestrømningstest efter 2 s dip i 5 ppm opløsning eller efter opløsninger med 0,5 til 5 ppm fri klor strømmede gennem testen i henholdsvis ca. 7:30 min eller 5:30 min. Bemærk, at den kortere strømningstid for stregkodestrømningstesten sammenlignet med den enkle flowtest opstår på grund af en ændring af papirretningen mod den hurtigere maskinretning.
Mens 0,5 ppm klor kun næppe kan detekteres med den kommercielle dip-test, er denne koncentration klart synlig for de hermed foreslåede flowtest. Indtil videre blev blækket bestående af farvestoffet i ethanol simpelthen trykt på et bomuldsskinnepapir uden yderligere tilsætningsstoffer. PH-værdien er for eksempel særlig vigtig for oxidationen af SA. Det viste sig, at pH fortrinsvis er sat til 6,0 for at øge både farverespons og følsomhed7,8. Derfor imprægnerede vi papiret med en phosphatbufferopløsning med pH 5 eller 6. Der blev faktisk observeret en klar intensitetsforøgelse for tests behandlet med buffer. Forøgelsen var imidlertid den samme for pH 5 og 6. Da imprægnering med buffer pH 6 fordoblede strømningstiden, hvorved tidsforsinkelsen på grund af buffer pH 5 var mindre end et minut, besluttede vi at bruge pH 5 bufferimpregnering til yderligere test for at give testresultater så hurtige og følsomme som muligt (jf. fig. 4, test markeret “5”). Følsomheden af flowtest kan øges yderligere ved at behandle højere volumener24, hvilket f.eks. kan opnås ved længere teststrimler25, en bredere prøvepude26 eller en blæserformet fugevæske27. En endnu enklere måde at øge mængden af prøve, der passerer reaktionszonen, består i tilføjelse af en væge efter reaktionszonen limet ind mellem teststrimlen og bagsidekortet (jf. Fig. 2e). Når det samme materiale anvendes til vægen og teststrimlen, fordobles prøvevolumenkapaciteten for vægenes længde. Da vi bruger væger halve længden af strømningstesten, er 1,5 gange analytvolumen Figur 4a viser test efter analyse af 2 ppm ch lorinopløsning. Flere stregkodelinjer er farvet til tests med yderligere væger end uden (fig. 4a, test markeret “A”).Kombination af buffer- og fugtspredningspuder fører til et højere antal farvede linjer med mere intens farve (fig. 4a, test markeret “5A”). Brug af et ekstra tykt pladepapir som væge (fig. 4a, test markeret “5B”) øges mængden af prøve analyseret yderligere (prøvemasser nævnt i fig. 4a). Imidlertid fører for høj prøveprøve til blødning af farvestoffet og mindre læsbare resultater. Endvidere var strømningstiden væsentligt længere i dette tilfælde på grund af den langsommere strømning i blotpapiret.
(a) Billeder af stregkodestrømningstest efter 2 ppm fri kloropløsning strømmede gennem testene i tiden under billeder. Massen, der er skrevet under billederne, vedrører den mængde prøve, der er absorberet ved testen, og som blev bestemt ved vejning. Substratet til forsøg markeret med “5” blev imprægneret med buffer pH 5 forud for udskrivning. Test markeret med “A” havde en yderligere 4,5 cm lang væge fremstillet af 2992 Schleicher & Schüll-papir ( 430 µm tykkelse, 180 g / m²), forsøg markeret med “B” havde en væge fremstillet af Biorad-blottingpapir (2,45 mm tykkelse, 734 g / m²). (B) Intensiteten af det lilla SA farvestof i afhængighed af klorkoncentrationen ekstraheret fra den første testlinje, som vist som eksempel på 2 ppm i (a). De stiplede linier blev integreret til styring af øjet og blev opnået ved en asymptotisk eksponentiel tilpasning (y = a – bcx) af datasættene. / p>
For at sammenligne effekten af buffer og yderligere væge over det detekterbare område med frit klor, intensiteten af den lilla farve i den første linie blev ekstraheret og plottet i fig. 4b. Bemærkelsesværdigt er farveintensitetsforøgelsen på grund af bufferimprægnering meget stærk for høj klorkoncentration , men ubetydelig for den mere interessante lave ende. Effekten af farveintensitetsforøgelsen relateret til vægen er relativt konstant over hele området, skønt Miller et al. fundet, at følsomhedsstigningen på grund af øget prøvevolumen er mindre for lave koncentrationer24. Forbedringen på grund af vægen i vores analyse virker ret lille. Imidlertid er det vigtigt for den lave ende, da vægens væsentligste forbedring er det øgede antal farvede striber og ikke den farveintensitet, der er tegnet i fig. 4b. Afslutningsvis er det i bedste fald muligt at detektere ned til 0,2 ppm frit klor ved hjælp af strømningstest med en ekstra væge. Bemærk, at 0,2 ppm frit klor forårsagede en visuelt observerbar lilla nuance under testen, men det er ikke muligt at bestemme en stiv detektionsgrænse ved den visuelle inspektion. For at gøre det ville en større feltundersøgelse, der involverer flere utrænede testere, være nødvendig, hvilket er uden for denne proof-of–principe-undersøgelse. beskrevet ovenfor, øger en flow-testopsætning væsentligt følsomheden af kloranalysen. Der er dog også en ulempe ved den langvarige kontakt mellem analyt og test: de fleste stærke oxidationsmidler, såsom frit klor, oxiderer ikke kun redoxfarvestoffet, men interagerer også med de fleste af de potentielle substratmaterialer, herunder cellulose som hovedmolekylær komponent i de brugte papirark13. Spormængder af klor kan forbruges ved reaktion med substratmaterialet, mens de strømmer til reaktionszonen, hvilket kan begrænse følsomheden til 0,2 ppm fri klor samt øge fejlen i den bestemte absolutte koncentration af klor. Sidstnævnte bliver et problem, hvis der skal påvises meget små frie klorkoncentrationer. For at øge følsomheden så meget som muligt, skal der vælges et mere oxidationsstabilt flow substratmateriale, og substratmaterialets stabilitet mod oxidationsprocesser skal evalueres.
Screening af oxidativ stabilitet blev udført af blanding af substratstykker med en 2 ppm chloropløsning. Det resterende chlorindhold i supernatanten i forskellige tidsintervaller blev analyseret fotometrisk efter DPD-farvning. Figur 5a viser klortab af opløsninger efter kontakt med forskellige cellulosesubstrater. Papir 2992 af bomuldsliner fra Schleicher & Schüll, som blev brugt til alle hidtil præsenterede tests, bruger en betydelig mængde klor. Allerede efter en kontakttid på få minutter, som er nødvendig for at opløsningen kan strømme gennem en test, reagerede mere end 0,5 ppm frit chlor med papiret. Meget rent, selvfremstillet laboratoriebomuldsforbindelsespapir og DBS-papiret fra Ahlstrom-Munksjö var væsentligt mere stabile end 2992-papiret, hvilket indikerer, at nogle papiradditiver i 2992 kan være mere reaktive end den rene cellulose. Men som tidligere nævnt reagerer cellulose i sig selv med klor, hvilket fører til et forbrug på 0,5 ppm efter 60 minutters kontakt af kloropløsningen med de rene bomuldsforingspapirer.Foroxiderende cellulose med en koncentreret fri kloropløsning i 4 timer øgede ikke papirets stabilitet, da sandsynligvis kun en mindre fraktion af hydroxylgrupper blev oxideret under denne behandling. En mere effektiv oxidativ behandling ved hjælp af en TEMPO-katalyseret oxidation havde en væsentlig indvirkning på stabiliteten af det laboratoriefremstillede papir: Overraskende blev dette præoxiderede papir mere reaktivt over for klor, hvilket kunne forklares med en forøgelse af overfladearealet, der udsatte mere hydroxylgrupper til oxidation. For at mindske det eksponerede celluloseoverfladeareal blev 2992 papir hornificeret ved at placere det natten over ved 120 ° C i en ovn, hvilket skulle resultere i irreversibel porelukning og vedhæftning af porevæggene til hinanden28. Imidlertid øgede denne behandling papirets reaktivitet yderligere, hvilket indikerer, at overfladeprocesserne af cellulosefibre endnu ikke er godt forstået og har brug for yderligere undersøgelse ud over omfanget af dette manuskript.
(a, b) Klortab på grund at komme i kontakt med substratprøver over tid i en 2 ppm chloropløsning (12 mg substrat pr. ml opløsning). Chlorkoncentrationen blev bestemt ved absorbansen af den oxiderede DPD ved 551 nm. “Blank” står for koncentrationen af den oprindelige kloropløsning i begyndelsen og slutningen af eksperimentet. (C) Billeder af 9 cm lange tests lavet af bufferimprægnerede papirsubstrater efter 5 og 1 ppm fri kloropløsning, der strømmer igennem til tid angivet under testen. (d) Billeder af 9 cm lange forsøg lavet af alternative, ikke-celluloseholdige substrater uden bufferimprægnering efter 5 ppm fri kloropløsning, der gennemstrømmes i den tid, der er angivet under testen. (a, c) Prøver består af følgende papirunderlag: Schleicher & Schüll 2992, Schleicher & Schüll 2992 hornet i en ovn ved 120 ° C, laboratoriefremstillede bomuldsskær papir, TEMPO-katalyseret præoxideret laboratoriefremstillet bomuldsskinnepapir, frit klor pre-oxideret laboratoriefremstillet bomuldsforingspapir (Cl2) og DBS-papir fra Ahlstrom-Munksjö. (b, d) Prøver består af følgende alternative substrater: PET substrater fra Ahlstrom-Munksjö 6613 (ren PET), 6613 H (med overfladeaktivt middel) og d 6614 (med bindemiddel), Spec-Wipe 3 fra VWR med 45% polyester og 55% cellulose, glasfiber 691 fra VWR og glasfiber MN 85/90 BF fra Macherey-Nagel. Strømningstiden er angivet under hvert testfoto. Bemærk, at strømningstiden for Schleicher & Schüll 2992 papir er forskellig for (c, d), fordi i (c) blev papiret brugt i tværretning (7:30 min) og i (d) i maskinretning (5:30 min), hvorved kun strømningstiden blev reduceret, og farveintensiteten ikke faldt signifikant. Farveintensitetsforskellen her skyldes det faktum, at alle test vist i (c) blev imprægneret med buffer forud for udskrivning, alle tests i (d) ikke.
Den fotometriske screening muliggør sammenligning af chlorreaktiviteten af flere substrater, hvorved forholdet mellem det valgte 12 mg substrat i kontakt med 1 ml 2 ppm chloropløsning er ret tilfældigt. En 9 cm lang og 0,5 cm bred flow-test lavet af 180 g / m² papir, såsom Schleicher & Schüll 2992-papir, vejer 81 mg og væger ca. 180 µl prøve, hvilket ville resultere i et forhold på 450 mg papir for 1 ml analytopløsning, der strømmer gennem testen. Hvis man overvejer, at kun 0,5 cm slutningen af en test har permanent kontakt med 0,5 ml kloropløsning, kommer dette forhold ned til 9 mg / ml, hvilket er tæt på de valgte 12 mg / ml til screening. På grund af denne store forskel mellem de to antagelser blev substratscreeningens relevans for testpræstationen kontrolleret. Figur 5c viser billeder af flowtests foretaget med de forskellige papirsubstrater, der er screenet i fig. 5a. Analysen af 5 ppm kloropløsning viser allerede store forskelle mellem substraterne. Mens for de mere oxidationsstabile papirsubstrater er alle 5 striber i stregkodetesten farvet, viste de mere reaktive papirer, der er forbehandlet med TEMPO-katalyseret oxidation eller hornificering, meget mindre striber. Desuden førte den kemiske præoxidation af bomuldsforene til en væsentlig forøgelse af strømningstiden og dermed også kontakttiden for test- og analytopløsningen. En slank intensitetsforskel mellem de farvede striber på 2992-papiret og de mere stabile alternative papirer blev set ved analyse af 1 ppm chlor. Men forskellene her var mindre markante end for de mindre stabile substrater. Fra testresultaterne fra de forskellige papirsubstrater bliver det klart, at klorstabilitetsscreeningen er relevant for testens ydeevne, og at der er behov for flere inerte substrater end cellulosepapir til en flowtest med meget lave detektionsgrænser.