p53-stien: positive og negative feedback-sløjfer

En række undersøgelser i litteraturen har identificeret 10 positive eller negative feedback-sløjfer i p53-stien (se figur 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10). Hver af disse sløjfer skaber et kredsløb sammensat af proteiner, hvis aktiviteter eller syntesehastigheder er påvirket af aktivering af p53, og dette resulterer igen i ændring af p53-aktivitet i en celle. Af disse er syv negative feedback-sløjfer, der modulerer p53-aktivitet ned (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyclin G, Wip-1 og Siah-1), og tre er positive feedback-sløjfer (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF og Rb), der modulerer p53-aktivitet. Alle disse netværk eller kredsløb er autoregulerende, idet de enten induceres af p53-aktivitet på transkriptionsniveau, transkriptionelt undertrykkes af p53 (p14 / 19 ARF, figur 3) eller reguleres af p53-inducerede proteiner. Seks af disse feedback-sløjfer virker gennem MDM-2 (MDM-2, cyclin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT og Rb) for at modulere p53-aktivitet.

Et spændende fund er, at p53-stien er tæt forbundet med anden signaltransduktion veje, der spiller en væsentlig rolle i oprindelsen af kræft. En af de første undersøgte forbindelser involverer p14 / p19ARF og MDM-2. P14 / 19 ARF-proteinet binder til MDM-2-proteinet og modulerer ned dets ubiquitinligaseaktivitet, hvilket øger niveauerne af p53-proteinet (Honda og Yasuda, 1999) (figur 3). Transkriptionen af p14 / 19 ARF-genet reguleres positivt af E2F-1 (Zhu et al., 1999) og beta-catenin (Damalas et al., 2001) og reguleres negativt af p53 i sig selv. Derudover øges niveauerne af p14 / 19 ARF-protein med Ras- og Myc-aktiviteter i en celle (figur 3). Kompleksiteten af reguleringen af p53 af p14 / p19 ARF er for nylig blevet gennemgået (Lowe og Sherr, 2003). P14 / 19 ARF-MDM-2-komplekserne er ofte lokaliseret i cellekernen på grund af de nukleolære lokaliseringssignaler, der er til stede i p14 / p19 ARF. Nukleolus er stedet for ribosomal biogenese, og p14 / 19 ARF-aktivitet i sig selv kan ændre hastigheden af RNA-behandling af den ribosomale RNA-forløber til modne ribosomale underenheder (Sugimoto et al., 2003). Således spiller p14 / 19 ARF ved at kontrollere MDM-2 og p53 niveauer og koordinere dette med ribosomal biogenese en vigtig rolle i cellecyklusregulering. Dette er for nylig blevet forstærket af demonstrationen om, at p14 / 19 ARF-proteinet også kan regulere Myc-aktivitet (og derfor cellestørrelse) (Datta et al., 2004). MDM-2 i nucleolus er dog ikke en passiv enhed. MDM-2-proteinet har vist sig at binde specifikt til tre store ribosomale underenhedsproteiner L5, L11 og L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), og bindingen af L5 (Dai og Lu, 2004) eller L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) til MDM-2 sænker dets ubiquitinligaseaktivitet. Derudover binder ringfingerdomænet af MDM-2 specifikt til en RNA-sekvens, der findes i den store ribosomale RNA-underenhed (Elenbaas et al., 1996). Mens alle disse observationer peger på en central rolle for MDM-2 og p14 / 19 ARF i reguleringen af ribosombiogenese og cellecyklussen, forstår vi ikke, hvordan disse observationer kommer sammen for at danne denne reguleringssløjfe.

Rb-proteinet kan findes i celler i et kompleks med MDM-2 og p53, hvilket resulterer i høj p53-aktivitet og forbedret apoptotisk aktivitet (Xiao et al., 1995). Høje niveauer af aktiv E2F-1, der ikke er bundet til Rb, skifter p53-responset fra G-1-anholdelse til apoptose. Både Rb og MDM-2 er phosphoryleret og inhiberet af cyclin E-cdk2 (figur 4). Når p53 aktiveres, stimulerer det syntesen af p21-proteinet, som inhiberer cyclin E-cdk2-aktivitet, og dette virker igen på Rb-MDM-2-komplekset, der fremmer p53-aktivitet og apoptose. Efter DNA-beskadigelse modificeres både MDM-2-proteinet og p53-proteinet af ATM-proteinkinasen (figur 4). Dette forbedrer p53-aktivitet på samme måde, som p53-MDM-2-Rb-komplekset øger p53-funktionen og er proapoptotisk. For en detaljeret nylig gennemgang af p53-Rb-E2F1-aksen, se Yamasaki (2003).

En del af aktiveringen af p53-proteinet involverer phosphorylering af p53-proteinet i seriner placeret ved rester 33 og 46 af p38 MAP-kinasen (figur 5). Denne p38 MAP-kinase aktiveres i sig selv ved fosforylering (reguleret af Ras-Raf-Mek-Erk-stien), der kan vendes eller inaktiveres af Wip-1-phosphatasen. Wip-1 er et p53-responsivt eller p53-reguleret gen, der danner en negativ autoregulatorisk sløjfe og forbinder p53- og Ras-stierne (Takekawa et al., 2000) (figur 5). Et aktiveret p53-protein regulerer transskriptionen af ubiquitinligasen Siah-1 positivt (Fiucci et al., 2004), som igen virker til at nedbryde beta-catenin-proteinet (Iwai et al., 2004) (figur 6). Beta-cateninniveauer kan regulere p14 / 19 ARF-genet, som igen regulerer MDM-2 negativt og resulterer i højere p53-niveauer (en positiv feedback-loop) (figur 6). Siah-1 forbinder således Wnt-beta-catenin-APC-stien til p53-stien. I nogle celletyper inducerer p53-proteinet transkriptionen af PTEN-genet (figur 7). PTEN-proteinet er en PIP-3-phosphatase. PIP-3 aktiverer AKT-kinasen, som har et antal antiapoptotiske proteinsubstrater inklusive MDM-2-proteinet. Fosforylering resulterer i translokation af MDM-2 i kernen, hvor den inaktiverer p53 (figur 7). Dette forbinder p53-banen med IGF-1-AKT-banen og danner en positiv feedback-loop for forbedret p53-aktivitet og nedsat AKT-aktivitet. Denne løkke i p53-regulering er også for nylig blevet gennemgået (Gottlieb et al., 2002). Disse positive og negative feedback-sløjfer udfører to ting: (1) de modulerer p53-aktivitet i cellen og (2) de koordinerer p53-aktivitet med andre signaltransduktionsveje, der regulerer celleindtrængning i cellecyklussen (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenin, IGF-1 og cyclin E-cdk2-aktiviteter).

Der er to yderligere p53 autoregulerende kredsløb, der negativ feedback på p53-funktion. En af de mest aktive af de p53-responsive gener er cyclin G-genet. Det transskriberes hurtigt til høje niveauer efter p53-aktivering i en lang række celletyper (Okamoto og Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). Cyclin G-proteinet danner et kompleks med PP2A-phosphatase, som fjerner en phosphatrest fra MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (figur 8), som tilsættes til MDM-2-proteinet ved hjælp af en cdk-kinase (Zhang og Prives, 2001) (figur 4). Phosphorylering af MDM-2 med cyclin A / cdk2 inhiberer dets aktivitet, og således forbedrer cyclin G-PP2A-phosphatase MDM-2-aktivitet og inhiberer p53. Mus med cyclin G-genet slået ud er levedygtige (Kimura et al., 2001), og cyclin G null-musembryofibroblaster har forhøjede p53-proteinniveauer i fravær af stress (Okamoto et al., 2002), hvilket viser, at denne feedback-loop er operationel in vivo og virker på basalniveauerne af p53 i en celle, ikke kun de højere p53-aktiverede niveauer efter stress. Den anden negative tilbagekoblingssløjfe involverer et medlem af p53-familien af transkriptionsfaktorer, som inkluderer p53, p63 og p73, der er beslægtet med struktur og funktion og har udviklet sig fra en fælles forløber. Efter et stressrespons aktiveres p53-genet, hvilket igen stimulerer transkriptionen af et bestemt splejset m-RNA fra p73-genet, kaldet p73 delta N (figur 9). Dette oversætter et p73-protein uden dets aminoterminale domæne. Alle tre af p53-familien af proteiner har lignende domænestrukturer sammensat af et N-terminal transkriptionelt aktiveringsdomæne bundet til et centralt kernedomæne, der binder til en specifik DNA-sekvens beskrevet ovenfor. Alle tre af p53-familietransskriptionsfaktorer genkender den samme DNA-sekvens, selvom p53, p63 og p73 er i stand til at initiere forskellige transkriptionelle programmer. Der er imidlertid et stort antal almindelige gener, der kan reguleres af alle tre proteiner som for nylig gennemgået i Harms et al. (2004).Når p53 således aktiverer transkriptionen af p73 delta N, kan p73 delta N-proteinet binde til mange af de p53-regulerede gener, men fraværet af et transaktiveringsdomæne får det til at fungere som en repressor eller konkurrent til p53-transkriptionsaktivering. På denne måde oprettes en negativ feedback-loop og p53-aktivitet falder (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (figur 9). Således involverer fem af disse positive eller negative feedback-kredsløb (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) gener og proteiner, der er centrale medlemmer af andre signaltransduktionsveje, mens to (cyclin G og p73 delta N) danner direkte negative feedback-sløjfer.

De sidste negative feedback-sløjfer, der skal diskuteres, kommer i form af ubiquitinligaser. Overraskende ser det ud til, at der er tre forskellige p53-ubiqutin-ligaseaktiviteter (MDM-2, Cop-1 og Pirh-1), der hver danner en autoregulerende loop, der resulterer i lavere p53-aktivitet (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (figur 10). Hvert gen aktiveres transkriptionelt af p53. Bare hvorfor der er dette niveau af redundans er i øjeblikket uklart. Flere muligheder er, at disse genprodukter udtrykkes eller virker optimalt i forskellige celle- eller vævstyper eller endda på forskellige udviklingsstadier. F.eks. Er MDM-2 knockout-musen dødelig ca. 6 dage efter befrugtning lige ved implantation af blastocysten. Dette kan udløses af den hypoxi, der skal forekomme på det tidspunkt, ved at aktivere p53 i fravær af MDM-2 og forårsage apoptose. I overensstemmelse med denne fortolkning er iagttagelsen om, at en p53, MDM-2 dobbelt knockout-mus er levedygtig og fødes så normalt som en p53-knockout-mus (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Dette er derfor i overensstemmelse med ideen om, at MDM-2-proteinet virker uden en backup-ubiquitin-ligaseaktivitet i blastocyst-stadiet, men disse andre proteiner muligvis muligvis en mere normal funktion på senere udviklingsstadier. Disse ideer kan nu testes. Det er også muligt, at en eller flere af disse tre ubiquitinligaser er involveret i opretholdelsen af p53-niveauer i den ikke-belastede eller basale tilstand, mens andre kun virker, efter at en stress-induceret p53 er produceret. De aktiverede p53 og de stressinducerede p53-proteiner har meget forskellige proteinmodifikationer, og virkningen af dette på aktiviteten af MDM-2, Cop-1 eller Pirh-2 er på nuværende tidspunkt uklar. Det forekommer sandsynligt, at hver af disse tre ubiquitinligaser danner proteinkomplekser i cellen, og de tilknyttede proteiner kan meget vel variere for hver af disse ligaser og forbinder dem med forskellige regulerende kredsløb. På nuværende tidspunkt er der meget kendt om MDM-2, og der er relativt lidt fokus på rollen som Cop-1 og Pirh-2, som kun er rapporteret i litteraturen det sidste år eller deromkring. Derudover blev p53 meget nylig vist sig at være substratet for endnu et E3 ubiquitin ligaseenzym, toporer (Rajendra et al., 2004). Det er stadig at afgøre, om toporer også er et transkriptionelt mål for p53, og derfor skal føjes til den voksende liste over proteiner, der bidrager til autoregulerende kontrol af p53-vejen. De næste par års undersøgelse bør tage disse spørgsmål op.

Som nævnt ovenfor involverer mange af de regulatoriske sløjfer MDM-2, hvilket fremhæver MDM-2’s centrale rolle i kontrollen af p53-aktivitet. En genetisk analyse af p53- og MDM-2-mutationer, der blokerer dette proteinkompleks, har identificeret kritiske aminosyrerester i hvert protein, der er vigtige for denne bindingsinteraktion (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Disse samme aminosyrerester har vist sig at skabe disse proteinkontakter i krystalstrukturen af aminoterminalen af HDM-2 (det humane protein) og et peptid fra aminoterminalen af p53 (Kussie et al., 1996) . Rester phenyalanin 19, tryptophan 23 og leucin 26 af p53 danner de vigtigste kontakter i MDM-2 hydrofobe lomme. Fosforylering af resterne serin 20 og muligvis serin 15 bør svække disse kontakter, og peptider og lægemidler, der konkurrerer med disse kontakter, blokerer p53 MDM-2-komplekset og fremmer apoptose i celler (Klein og Vassilev, 2004). Således er p53-MDM-2-komplekset og MDM-2 ubiquitin-ligaseaktiviteten blevet et vigtigt lægemiddelmål for nogle kræftformer. I omkring en tredjedel af humane sarkomer og i nogle leukæmier og glioblastomer er HDM-2-genet blevet amplificeret, og dette protein overudtrykkes. P53-genet er vildtype, og p53-proteinet er tilsyneladende inaktivt, så lægemidler, der bryder p53-HDM-2-komplekset, skal aktivere p53. Derudover synes mange andre kræftformer at udtrykke HDM-2-genproduktet ved høje niveauer, selv når HDM-2-genet ikke amplificeres. I disse typer kræftformer, der blokerer HDM-2-aktivitet eller frigørelse af p53 fra dette kompleks, kan det godt inducere apoptose selektivt i kræftcellerne. Dette kan også forbedre kemoterapeutisk aktivitet hos nogle lægemidler, der aktiverer p53.

Den autoregulerende sløjfe p53-MDM-2 forudsiges at oprette en oscillator med p53- og MDM-2-niveauer, der stiger og falder med tiden og ud af fase i cellen. Dette er blevet demonstreret først ved at måle MDM-2 og p53 niveauer ved anvendelse af Western blots af proteiner fra celler i kultur, der gennemgår et p53 stressrespons (Lev Bar-Or et al., 2000). Mens svingninger observeres og dæmpes med tiden, er dette eksperiment gennemsnitlige proteinkoncentrationer fra mange celler i kultur, der kan være ude af fase i deres svingninger, hvilket giver anledning til konstruktiv eller destruktiv interferens. Af denne grund blev fluorescensmærkede p53- og HDM2-fusionsproteiner afbildet i individuelle celler for at følge ændringerne i p53- og HDM-2-niveauer i celler, der gennemgår et p53-stressrespons. De forventede svingninger ud af fase blev observeret, og overraskende var antallet af svingninger i en celle proportional med den dosis af stråling, der blev givet til disse celler (Lahav et al., 2004). Dette antyder, at p53 kan måle intensiteten af et stresssignal på en digital måde (antal svingninger) og ikke på en analog måde (højere p53-koncentrationer). Lignende svingninger er blevet observeret i andre signaltransduktionsveje, der har negative autoregulerende sløjfer, såsom NF-κ-B-stien med NF-κ-B- og I-κ-B-proteinerne (Scott et al., 1993). Disse digitale signaler, der stammer fra svingninger i mængden af transkriptionsfaktorer, kan meget vel resultere i et mønster med periodisk genekspression. Imidlertid er det uklart, hvordan digitale signaler på transkriptionsfaktorniveau oversættes til analoge signaler på niveauet for mængden af mRNA produceret af et gen. Disse eksperimenter fører til muligheden for, at forskellige antal svingninger, timing eller bølgelængde af svingningerne eller amplituden af disse svingninger kan påvirke det valgte mønster for genekspression og resultatet (cellecyklusstop, apoptose eller ældning) af p53 svar.

Hvorfor er der så mange feedback-sløjfer i p53-stien? Der er mange svar på dette spørgsmål. Alle mekanismer er muligvis ikke aktive i den samme celle eller vævstype eller på de samme stadier under udviklingen. Feedbacksløjfer af den her beskrevne type giver et middel til at forbinde p53-stien med andre signaltransduktionsveje og koordinere de cellulære signaler til vækst og opdeling. Afskedigelser i et system kan undertiden forhindre fejl, og et backupsystem reducerer fænotypen af mutationer. På den anden side kan ikke alle tilbagekoblingssløjferne vist i figur 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10 tåle tidstesten og yderligere eksperimentering. Mange af disse veje er belyst ved eksperimenter udført med kræftceller i kultur, der har mutationer, der ændrer disse veje. Selv normale celler i kultur eller knockout-mus (på grund af tilpasning til mutationen) afspejler muligvis ikke alle de betingelser, der forekommer i normale celler og organer in vivo. Det er særlig vanskeligt at bevise, at en specifik proteinkinase eller phosphatase virker på et specifikt substrat in vivo og har et resultat, der kan måles kvantitativt. Således har vi brug for fortsat at teste og udfordre de funktioner og veje, som vi mener fungerer i en celle. Disse konstruktioner, der er vist i figur 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 10, er dog nyttige til at formulere hypoteser og teste ideer, der helt sikkert vil føre til ny indsigt i kræftens natur og design af lægemidler og stoffer, der selektivt dræber kræftceller.