4 Pili
Pili er filamentøse, ekstracellulære strukturer, der tillader bakterier at klæbe til biotiske og abiotiske overflader. En række pili er blevet identificeret på celleoverfladen af Aeromonas spp. med tidlige undersøgelser, der oprindeligt beskriver to forskellige pili-typer på grund af deres strukturelle forskelle: kort stiv (S / R) og langbølget (L / W) pili (Carrello, Silburn, Budden, & Chang, 1988; Ho, Mietzner, Smith, & Schoolnik, 1990). Aeromonas-stammer opsamlet fra miljøprøver blev rapporteret at fortrinsvis udvise stort antal S / R pili, hvorimod isolater fra kliniske prøver var mere tilbøjelige til at producere et lille antal L / W pili (Carrello et al., 1988); foreslår L / W pili at være involveret i virulens. I gramnegative bakterier er der fire hovedgrupper af bakteriel pili: pili samlet af ‘chaperone-usher pathway’, type IV pili, pili samlet af den ekstracellulære nucleation pathway og pili samlet af den ‘alternative chaperone-usher pathway’. Aeromonas spp. har vist sig at udtrykke type I pili samlet af ‘chaperone-usher pathway’ og type IV pili. Ultrastrukturelle undersøgelser udført af Ho et al. (1990) på S / R pilus af A. hydrophila AH26 afslørede pilin (større gentagelsesenhed af pilus) at have homologi med type I og Pap (pyelonephritis-associeret pili) pili fra E. coli (Ho et al., 1990), og hører til gruppen af pili samlet på chaperone-usher-stien. Type I pili fra mesofile Aeromonas-arter er blevet associeret med autoagglutination af celler, men ikke med patogenicitet. Overholdelsesundersøgelser fra Honma og Nakasone (1990) viste, at selvom deres A. hydrophila-stamme (Ae6) var stærkt klæbende til tarmene fra kanin og mennesker, blokerede antistoffer mod S / R-pili ikke vedhæftning til celler og skar S / R-pili af havde heller ingen affinitet til værtsceller. De gener, der koder for type I pili, er nu blevet placeret i genomerne af en række Aeromonas-arter, herunder nogle mesofile arter og den psykrofile aeromonad, A. salmonicida subsp salmonicida (Reith et al., 2008; Seshadri et al., 2006). I modsætning til mesofile aeromonader ser typen I pilus af A. salmonicida ud til at have en rolle i kolonisering af atlantisk laks. Mutationsstudier udført af Dacanay og kollegaer (2010) viste, at A. salmonicida mangler type I pilus operon har en nedsat evne til at klæbe til mave-tarmkanalen i atlantisk laks. Imidlertid var den mutante evne til at invadere værten, når den var overholdt, sammenlignelig med vildtypen, hvilket antyder, at type I-pili kun er involveret i de indledende faser af kolonisering (Dacanay et al., 2010).
Betydelige mængder arbejde udført på aeromonadadhæsion har koncentreret sig om L / W-pilen. Tilslutningsundersøgelser med en række mesofile stammer i 1990’erne fremhævede vigtigheden af disse vedhæng i koloniseringen af værtsvæv. Mekanisk fjernelse af L / W-pili fra bakteriecelleoverfladen eller forbehandling af bakterieceller med et anti-pilin-antistof blev vist at blokere bakteriel adhærens til en række dyre- og humane cellelinier (Barnett & Kirov, 1999; Hokama, Honma, & Nakasone, 1990; Honma & Nakasone, 1990; Iwanaga & Hokama, 1992; Kirov, Hayward, & Nerrie, 1995; Nakasone, Iwanaga, Yamashiro, Nakashima, & Albert, 1996). L / W-piliner har generelt en molekylvægt mellem 19 og 23 kDa og er antigenisk forskellige, hvor kun den N-terminale aminosyresekvens viser homologi til type IV-piliner (Kirov & Sanderson, 1996). Nogle type IV pili er i stand til at danne filamentøse netværk eller bundter (Kirov, Hayward, et al., 1995), og det er især disse bundtdannende pili (Bfp), der betragtes som vigtige koloniseringsfaktorer i mesofil Aeromonas spp. Den første Bfp isoleret fra en art af Aeromonas var fra A. veronii biovar sobria (stamme BC88) (Kirov & Sanderson, 1996). Den N-terminale sekvens af hovedpilinen fra denne Bfp viste sekvenshomologi med den mannosefølsomme hæmagglutinin (MSHA) type IV pilin fra Vibrio cholerae (Kirov & Sanderson, 1996), som hører til til den ‘klassiske’ type IVa-familie af pilins sammenlignet med den type IVb-familie, som Bfp normalt hører til. A. veronii bv. sobria bundtdannende pilus blev efterfølgende ved genetiske midler vist at være medlem af MSHA pilus-familien (Hadi et al., 2012). Ekspression af MSHA pilus i disse undersøgelser syntes at være miljøreguleret, da A. veronii biovar sobria viste øget ekspression, når den blev dyrket ved 22 ° C i flydende kultur, sammenlignet med 37 ° C på faste medier (Kirov & Sanderson, 1996). Disse resultater stemte også overens med tidligere undersøgelser fra Kirov, Hayward, et al.(1995) hvor A. veronii bv. sobria-isolater viste optimal ekspression af trådformede strukturer ved 22 ° C, hvor nogle få miljøstammer viste optimal ekspression ved 7 ° C. Yderligere undersøgelser af typen IV pili til stede på A. veronii bv. sobria resulterede i opdagelsen af et nyt type IV pilus-system, Tap pilus, som viste sig at adskille sig markant fra Bfp (Kirov & Sanderson, 1996). Kort efter dets første påvisning i A. veronii bv. sobria, Tap pili biogenesegener blev identificeret i A. hydrophila (Ah65) (tapABCD) og viste sig at dele homologi med type IV pilusgener i P. aeruginosa (pilABCD); generne fra A. hydrophila var i stand til at komplementere tilsvarende mutationer i P. aeruginosa (Pepe, Eklund, & Strom, 1996). Selvom Tap pili er til stede i alle Aeromonas-stammer, hvis genom indtil videre er sekventeret, vides der meget lidt om deres funktion. Sletning af Tap pilin-genet (tapA) og derfor sletning af Tap pilus-filamentet havde ingen effekt på evnen til klinisk A. veronii bv. sobria-isolater for at klæbe til HEp-2-celler, klæbe til humane tarmceller eller kolonisere en ung musemodel; lignende fund blev også rapporteret med et fiskisolat af A. hydrophila (Kirov, Barnett, Pepe, Strom, & Albert, 2000). Tap pilus bidrager til patogeniciteten af den psykrofile aeromonad A. salmonicida subsp. salmonicida ved infektion af atlantisk laks; skønt det ikke er vigtigt for virulens, da tapA-mutanter bevarer meget af deres evne til at kolonisere værten (Boyd et al., 2008). Genekspressionsanalyse i A. salmonicida har vist, at Tap pilus udtrykkes konstitutivt, og sammen med tapABCD er Tap pilus-systemet også kodet på yderligere 18 gener spredt rundt om genomet (Boyd et al., 2008) svarende til type IV pili gener af Pseudomonas og Neisseria spp. (Mattick, 2002). Mens Tap Pilus’s rolle stadig skal belyses, har dens biogenese stærke implikationer i virulens på andre måder. TapD, en prepilin-peptidase (Pepe et al., 1996) er ikke kun nødvendig til behandling af prepilinerne (fra flere pilus-systemer), før de inkorporeres i pilus-filamentet, men også til behandlingen af pseudopilinerne i T2SS, er afgørende for udskillelsen af mange virulensfaktorer, såsom proteaser, hæmolysin og DNase (Hadi et al., 2012; Kirov et al., 2000).
Sammen med MSHA og Tap pilus er en tredje type IV pilus, der hører til type IVb-klassen, er også blevet identificeret i A. salmonicida subsp. salmonicida, navngivet Flp pilus på grund af sin homologi med Flp-systemet af Actinobacillus actinomycetemcomitans (Boyd et al., 2008). I A. salmonicida er generne for denne pilus placeret i en enkelt operon (flpA-L), og dens ekspression er jernreguleret med opregulering af generne, der forekommer under lave jernforhold (Boyd et al., 2008). Meget lidt er kendt om Flp pilus’s rolle i Aeromonas, og på trods af at det er et reguleret system ser det ikke ud til at være involveret i A. salmonicida virulens, da flp-mangelfulde stammer fuldt ud bevarede deres evne til at kolonisere og inficere atlantisk laks (Boyd et al. ., 2008). Flp pilus har vist sig at være udbredt blandt bakterier og bidrager til dannelse af biofilm og autoagglutination (Kachlany et al., 2000; Planet, Kachlany, Fine, DeSalle, & Figurski, 2003) ; det kan derfor være vigtigere i bakterie-bakterie-interaktioner snarere end værtcelle-interaktioner.
Derfor er tre forskellige type IV-pili-systemer blevet beskrevet i aeromonader, hvor de fleste arter har mindst to af disse. For mesofile aeromonader antydede tidlige tilslutningsundersøgelser i 1990’erne, at den MSHA bundledannende pilus er den største filamentøse vedhæng, der er ansvarlig for vævets vedhæftning og kolonisering, men først for nylig blev dette genetisk bestemt af Hadi et al. (2012). Et 22 kb Bfp MSHA-locus blev isoleret og karakteriseret fra A. veronii bv. sobria, som blev fundet at bestå af 17 gener arrangeret i to operoner, hvoraf fire kodede præfiliner (en større og tre mindre) underenhederne af pilus-filamentet (Hadi et al., 2012). Det blev konkluderet, at alle fire prepiliner er essentielle for pilusbiogenese med individuelle mutationer i hvert prepilingen, der reducerer bakteriel adhærens til HEp-2-celler med 90% (Hadi et al., 2012). Evnen hos mutanterne til at danne biofilm blev også analyseret og påvist, at MSHA pilus-generne fra A. veronii bv. sobria er afgørende for dannelse af biofilm. Disse undersøgelser bekræftede, at MSHA pilus er det største overholdelsessystem i A. veronii bv. sobria, og dette kan også være tilfældet for andre mesofile Aeromonas-arter. Selvom MSHA pilus-operonen er til stede i A. salmonicida, er der en sletning af otte gener inden i operonen, inklusive genet, der koder for hovedpilinen (Boyd et al., 2008). MSHA pilus i A.salmonicida forventes derfor ikke at blive udtrykt og synes således kun at hjælpe virulensen af mesofile aeromonader.