Rendimiento de las pruebas de flujo de Cl2 en comparación con una prueba de inmersión convencional
Primero, comparamos una prueba de inmersión en cloro libre disponible comercialmente de Merck con una prueba de flujo simple en papel para investigar la influencia general de un flujo capilar impulsado en la sensibilidad de la prueba, es decir, para abordar la pregunta, si una exposición prolongada del colorante al analito solución aumenta la sensibilidad.
Para eso, se imprimió una almohadilla ancha de tinta SA en un papel de borra de algodón de 9 cm de longitud sin ningún otro aditivo. La figura 3 muestra que la inmersión de la zona de reacción de esta tira de papel en una solución de cloro de 5 ppm conduce a una intensidad de color comparable a la prueba de inmersión comercial. Sin embargo, colocar la prueba de flujo solo en una pequeña cantidad de solución de analito que no cubre la zona de reacción inmediatamente pero fluye por fuerzas capilares dentro de 7-8 min hasta el final de la tira de papel de 9 cm de largo, conduce a un color claramente más alto intensidad en comparación con la prueba de inmersión disponible comercialmente. Además de la intensidad del color, el ancho de la almohadilla de color también depende de la concentración de cloro. Para una mejor legibilidad, es útil utilizar una funda alrededor de la tira de papel con una abertura, como sugirieron Bauer et al.9, para que el usuario se concentre en la intensidad del color para interpretar los resultados. Alternativamente, es posible imprimir una almohadilla de tinte aún más amplia y usar una lectura de detección basada en la distancia17,18,19. Sin embargo, la sección coloreada no es homogénea y se desvanece hacia el final, lo que dificulta la medición de su longitud. La impresión de líneas de tinte separadas en una prueba de flujo de código de barras20,21,22,23 en lugar de una sección de tinte, facilita la lectura visual, ya que tanto la intensidad del color como el número de líneas se pueden comparar para un análisis semicuantitativo. La Figura 3 (abajo) muestra escaneos de tales pruebas de flujo de códigos de barras con cinco líneas después del contacto con diferentes soluciones de cloro. Nuevamente, el color de la prueba de flujo es mucho más intenso que el de la prueba sumergida. Finalmente, la resolución con respecto a diferentes concentraciones se mejora mediante la configuración del código de barras en comparación con una prueba de flujo simple. Por lo tanto, estos resultados sugieren que una prueba de flujo basada en papel conduce a una mayor sensibilidad que una prueba de inmersión y, además, una prueba de flujo permite patrones de impresión más complejos que pueden simplificar un análisis semicuantitativo.
Imágenes de tiras reactivas comerciales de cloro libre después de 2 s de inmersión en una solución de cloro libre de 5 a 0,5 ppm en comparación con las pruebas de flujo de 9 cm de largo y las pruebas de flujo de código de barras después de 2 s de inmersión en una solución de 5 ppm o después de soluciones de 0,5 a 5 ppm de cloro libre fluyó a través de la prueba durante aproximadamente 7:30 min o 5:30 min respectivamente. Tenga en cuenta que el tiempo de flujo más corto para la prueba de flujo del código de barras en comparación con la prueba de flujo simple surge debido a un cambio de la orientación del papel hacia la dirección más rápida de la máquina.
Mientras que 0,5 ppm de cloro apenas se pueden detectar con la prueba de inmersión comercial, esta concentración es claramente visible para las pruebas de flujo propuestas por el presente. Hasta ahora, la tinta que consiste en el tinte en etanol se imprimía simplemente en un papel de borra de algodón sin más aditivos. El pH es, por ejemplo, especialmente importante para la oxidación de SA. Se encontró que el pH se establece preferiblemente en 6,0 para aumentar tanto la respuesta al color como la sensibilidad7,8. Por lo tanto, impregnamos el papel con una solución tampón de fosfato de pH 5 o 6. De hecho, se observó un claro aumento de intensidad para las pruebas tratadas con tampón. Sin embargo, el aumento fue el mismo para pH 5 y 6. Dado que la impregnación con tampón pH 6 duplicó el tiempo de flujo, por lo que el retraso debido al tampón pH 5 fue de menos de un minuto, decidimos usar impregnación con tampón pH 5 para pruebas posteriores. para obtener resultados de prueba lo más rápido y sensible posible (ver Fig. 4, prueba marcada con «5»). La sensibilidad de las pruebas de flujo se puede aumentar aún más procesando volúmenes más altos24, que se pueden lograr, por ejemplo, con tiras de prueba más largas25, a una almohadilla de muestra más ancha26 o una almohadilla de mecha en forma de abanico27.Una forma aún más sencilla de aumentar la cantidad de muestra que pasa por la zona de reacción consiste en la adición de una mecha después de la zona de reacción pegada entre la tira reactiva y la tarjeta de respaldo (cf. Fig. 2e). Cuando se utiliza el mismo material para la mecha y la tira reactiva, la capacidad de volumen de la muestra se duplica para la longitud de la mecha. Como usamos mechas de la mitad de la longitud de la prueba de flujo, 1,5 veces el volumen del analito es La figura 4a muestra las pruebas después del análisis de 2 ppm ch solución de loro. Hay más líneas de códigos de barras coloreadas para las pruebas con mechas adicionales que sin ellas (Fig. 4a, prueba marcada con «A»).La combinación de tampón y almohadillas absorbentes conduce a un mayor número de líneas coloreadas con un color más intenso (Fig. 4a, prueba marcada con «5A»). Usar un papel secante extra grueso como mecha (Fig. 4a, prueba marcada «5B») aumenta la cantidad de muestra analizada adicionalmente (masas de muestra mencionadas en la Fig. 4a). Sin embargo, un flujo de muestra demasiado alto conduce al sangrado del tinte y a resultados menos legibles. Además, el tiempo de flujo fue sustancialmente más largo en este caso debido al flujo más lento en el papel secante.
(a) Imágenes de pruebas de flujo de códigos de barras después de que 2 ppm de solución de cloro libre fluyeran a través de las pruebas durante el tiempo por debajo del imágenes. La masa escrita debajo de las imágenes se relaciona con la cantidad de muestra absorbida por la prueba, que se determinó pesando. El sustrato para las pruebas marcadas con «5» se impregnó con tampón pH 5 antes de la impresión. Las pruebas marcadas con «A» tenían una mecha adicional de 4,5 cm de largo hecha de papel 2992 Schleicher & Schüll ( 430 µm de espesor, 180 g / m²), las pruebas marcadas con «B» tenían una mecha hecha de papel secante Biorad (2,45 mm de espesor, 734 g / m²). (B) Intensidad del colorante púrpura SA en función de la concentración de cloro extraído de la primera línea de pruebas, como se muestra a modo de ejemplo para 2 ppm en (a). Las líneas discontinuas se integraron para guiar el ojo y se obtuvieron mediante un ajuste exponencial asintótico (y = a – bcx) de los conjuntos de datos.
Para comparar el efecto del tampón y la mecha adicional sobre el rango detectable de cloro libre, La intensidad del color púrpura de la primera línea se extrajo y se representó en la Fig. 4b. Sorprendentemente, el aumento de la intensidad del color debido a la impregnación del tampón es muy fuerte para una alta concentración de cloro , pero insignificante para los más interesantes de gama baja. El efecto del aumento de la intensidad del color relacionado con la mecha es relativamente constante en todo el rango, aunque Miller et al. encontraron que el aumento de sensibilidad debido al aumento del volumen de muestra es menor para concentraciones bajas24. La mejora debida a la mecha en nuestro análisis parece bastante pequeña. Sin embargo, es importante para el extremo inferior ya que la principal mejora de la mecha es el mayor número de franjas de colores y no la intensidad del color que se representa en la figura 4b. En conclusión, en el mejor de los casos es posible detectar hasta 0,2 ppm de cloro libre mediante pruebas de flujo con una mecha adicional. Tenga en cuenta que 0,2 ppm de cloro libre causó un tono púrpura visualmente observable en la prueba, pero no es posible determinar un límite rígido de detección en esa inspección visual. Para hacerlo, sería necesario un estudio de campo más grande que involucre a múltiples probadores no capacitados, lo cual está fuera del alcance de este estudio de prueba de principio.
Consumo de Cl2 por sustratos de prueba de flujo
Como discutido anteriormente, una configuración de prueba de flujo aumenta sustancialmente la sensibilidad del análisis de cloro. Sin embargo, también hay un inconveniente del contacto prolongado entre el analito y la prueba: la mayoría de los agentes oxidantes fuertes, como el cloro libre, no solo oxidan el tinte redox, sino que también interactúan con la mayoría de los materiales de sustrato potenciales, incluida la celulosa como principal componente molecular de las hojas de papel usadas 13. Se pueden consumir trazas de cloro por reacción con el material del sustrato mientras fluye hacia la zona de reacción, lo que puede limitar la sensibilidad a 0,2 ppm de cloro libre, así como aumentar el error de la concentración absoluta determinada de cloro. Esto último se convierte en un problema si se van a detectar concentraciones muy pequeñas de cloro libre. Para aumentar la sensibilidad tanto como sea posible, se debe seleccionar un material de sustrato de flujo más estable a la oxidación y se debe evaluar la estabilidad del material de sustrato frente a los procesos de oxidación.
El cribado de estabilidad oxidativa fue realizado por mezclar piezas de sustrato con una solución de cloro de 2 ppm. El contenido de cloro restante en el sobrenadante para diferentes intervalos de tiempo se analizó fotométricamente después de la tinción con DPD. La Figura 5a muestra la pérdida de cloro de las soluciones después del contacto con diferentes sustratos de celulosa. El papel de borra de algodón 2992 de Schleicher & Schüll, que se utilizó para todas las pruebas presentadas hasta ahora, consume una cantidad sustancial de cloro. Ya después de un tiempo de contacto de unos minutos, que son necesarios para que la solución fluya a través de una prueba, más de 0,5 ppm de cloro libre reaccionó con el papel. El papel de borra de algodón de laboratorio muy puro y el papel DBS de Ahlstrom-Munksjö eran sustancialmente más estables que el papel 2992, lo que indica que algunos aditivos de papel en 2992 pueden ser más reactivos que la celulosa pura. Pero como se mencionó anteriormente, la propia celulosa también reacciona con el cloro, lo que lleva a un consumo de 0,5 ppm después de 60 minutos de contacto de la solución de cloro con los papeles de borra de algodón puro.La preoxidación de la celulosa con una solución concentrada de cloro libre durante 4 h no aumentó la estabilidad del papel ya que probablemente sólo una pequeña fracción de los grupos hidroxilo se oxidó durante este tratamiento. Un tratamiento oxidativo más eficaz utilizando una oxidación catalizada por TEMPO tuvo un efecto sustancial en la estabilidad del papel fabricado en laboratorio: Sorprendentemente, este papel preoxidado se volvió más reactivo al cloro, lo que podría explicarse por un aumento de la superficie expuesta más grupos hidroxilo para oxidación. Para disminuir el área de superficie de celulosa expuesta, el papel 2992 se calentó colocándolo durante la noche a 120 ° C en un horno, lo que debería resultar en un cierre irreversible de los poros y la adhesión de las paredes de los poros entre sí28. Sin embargo, también este tratamiento aumentó aún más la reactividad del papel, lo que indica que los procesos superficiales de las fibras de celulosa aún no se comprenden bien y necesitan más investigación más allá del alcance de este manuscrito.
(a, b) Pérdida de cloro debida entrar en contacto con muestras de sustrato a lo largo del tiempo en una solución de cloro de 2 ppm (12 mg de sustrato por ml de solución). La concentración de cloro se determinó mediante la absorbancia del DPD oxidado a 551 nm. «Blanco» representa la concentración de la solución de cloro inicial al principio y al final del experimento. (C) Imágenes de pruebas de 9 cm de largo hechas con sustratos de papel impregnados con tampón después de que fluye una solución de cloro libre de 5 y 1 ppm para el (d) Imágenes de pruebas de 9 cm de largo hechas de sustratos alternativos no celulósicos sin impregnación tampón después de que fluye una solución de cloro libre de 5 ppm durante el tiempo indicado debajo de la prueba. (a, c) Las muestras consisten en los siguientes sustratos de papel: Schleicher & Schüll 2992, Schleicher & Schüll 2992 horneado en un horno a 120 ° C, borras de algodón hechas en laboratorio papel, papel de borra de algodón pre-oxidado de laboratorio catalizado por TEMPO, papel de borra de algodón de laboratorio pre-oxidado con cloro libre (Cl2) y papel DBS de Ahlstrom-Munksjö. (b, d) Las muestras constan de los siguientes sustratos alternativos: PET sustratos de Ahlstrom-Munksjö 6613 (PET puro), 6613 H (con tensioactivo) y d 6614 (con aglutinante), Spec-Wipe 3 de VWR con 45% de poliéster y 55% de celulosa, fibra de vidrio 691 de VWR y fibra de vidrio MN 85/90 BF de Macherey-Nagel. El tiempo de flujo se muestra debajo de cada foto de prueba. Tenga en cuenta que el tiempo de flujo para el papel Schleicher & Schüll 2992 es diferente para (c, d) porque en (c) el papel se utilizó en dirección transversal (7:30 min) y en (d) en la dirección de la máquina (5:30 min), por lo que solo se redujo el tiempo de flujo y la intensidad del color no disminuyó significativamente. La diferencia de intensidad de color aquí se debe al hecho de que todas las pruebas que se muestran en (c) se impregnaron con la impresión en búfer antes de la impresión, todas las pruebas en (d) no.
El tramado fotométrico permite comparar la reactividad al cloro de varios sustratos, por lo que la proporción del sustrato de 12 mg elegido en contacto con 1 ml de solución de cloro a 2 ppm es bastante aleatoria. Una prueba de flujo de 9 cm de largo y 0,5 cm de ancho hecha de papel de 180 g / m², como el papel Schleicher & Schüll 2992, pesa 81 mg y absorbe aproximadamente 180 µl de muestra, lo que resulta en una proporción de 450 mg de papel por 1 ml de solución de analito que fluye a través de la prueba. Si se considera que solo el extremo de 0,5 cm de una prueba tiene contacto permanente con 0,5 ml de solución de cloro, esta relación se reduce a 9 mg / ml, que se acerca a los 12 mg / ml elegidos para el cribado. Debido a esta gran diferencia entre los dos supuestos, se comprobó la relevancia del cribado del sustrato para el rendimiento de la prueba. La Figura 5c muestra imágenes de pruebas de flujo realizadas con los diferentes sustratos de papel seleccionados en la Figura 5a. El análisis de una solución de cloro a 5 ppm ya muestra grandes diferencias entre los sustratos. Mientras que para los sustratos de papel más estables a la oxidación, las 5 franjas de la prueba del código de barras están coloreadas, los papeles más reactivos pretratados por oxidación o hornificación catalizada por TEMPO mostraron muchas menos franjas. Además, la preoxidación química de las borras de algodón condujo a un aumento sustancial del tiempo de flujo y, por tanto, también del tiempo de contacto de la prueba y la solución de analito. Al analizar 1 ppm de cloro, se observó una pequeña diferencia de intensidad entre las rayas de colores del papel 2992 y los papeles alternativos más estables. Pero las diferencias aquí fueron menos pronunciadas que para los sustratos menos estables. A partir de los resultados de las pruebas de los diferentes sustratos de papel, queda claro que el cribado de la estabilidad del cloro es relevante para el rendimiento de la prueba y que se necesitan más sustratos inertes que el papel de celulosa para una prueba de flujo con límites de detección muy bajos.