La vía p53: bucles de retroalimentación positiva y negativa

Una variedad de estudios en la literatura han identificado 10 bucles de retroalimentación positiva o negativa en la vía p53 (ver Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10). Cada uno de estos bucles crea un circuito compuesto por proteínas cuyas actividades o tasas de síntesis están influenciadas por la activación de p53, y esto a su vez da como resultado la alteración de la actividad de p53 en una célula. De estos, siete son bucles de retroalimentación negativa que modulan la actividad de p53 (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, ciclina G, Wip-1 y Siah-1) y tres son bucles de retroalimentación positiva (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF y Rb) que modulan la actividad de p53. Todas estas redes o circuitos son autorregulatorios porque son inducidos por la actividad de p53 a nivel transcripcional, reprimidos transcripcionalmente por p53 (p14 / 19 ARF, Figura 3) o están regulados por proteínas inducidas por p53. Seis de estos circuitos de retroalimentación actúan a través de MDM-2 (MDM-2, ciclina G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT y Rb) para modular la actividad de p53.

Un hallazgo interesante es que la vía p53 está íntimamente ligada a otra transducción de señales vías que juegan un papel importante en los orígenes del cáncer. Una de las primeras conexiones estudiadas involucra p14 / p19ARF y MDM-2. La proteína p14 / 19 ARF se une a la proteína MDM-2 y modula su actividad de ubiquitina ligasa, aumentando los niveles de la proteína p53 (Honda y Yasuda, 1999) (Figura 3). La transcripción del gen ARF p14 / 19 está regulada positivamente por E2F-1 (Zhu et al., 1999) y beta-catenina (Damalas et al., 2001) y regulada negativamente por la propia p53. Además, los niveles de proteína ARF p14 / 19 aumentan por las actividades Ras y Myc en una célula (Figura 3). La complejidad de la regulación de p53 por p14 / p19 ARF ha sido revisada recientemente (Lowe y Sherr, 2003). Los complejos p14 / 19 ARF-MDM-2 a menudo se localizan en el nucleolo de la célula debido a las señales de localización nucleolar presentes en p14 / p19 ARF. El nucleolo es el sitio de la biogénesis ribosómica y la actividad ARF de p14 / 19 en sí misma puede alterar la velocidad de procesamiento del ARN del precursor del ARN ribosómico en subunidades ribosómicas maduras (Sugimoto et al., 2003). Por lo tanto, p14 / 19 ARF al controlar los niveles de MDM-2 y p53 y coordinar esto con la biogénesis ribosómica juega un papel importante en la regulación del ciclo celular. Esto ha sido reforzado recientemente por la demostración de que la proteína ARF p14 / 19 también puede regular la actividad de Myc (y por lo tanto el tamaño celular) (Datta et al., 2004). Sin embargo, el MDM-2 en el nucleolo no es una entidad pasiva. Se ha demostrado que la proteína MDM-2 se une específicamente a tres grandes proteínas de subunidad ribosómica L5, L11 y L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), y la unión de L5 (Dai y Lu, 2004) o L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) a MDM-2 reduce su actividad de ubiquitina ligasa. Además, el dominio del dedo anular de MDM-2 se une específicamente a una secuencia de ARN que se encuentra en la subunidad de ARN ribosómico grande (Elenbaas et al., 1996). Si bien todas estas observaciones apuntan a un papel central para MDM-2 y p14 / 19 ARF en la regulación de la biogénesis del ribosoma y el ciclo celular, no entendemos cómo estas observaciones se unen para formar este bucle regulador.

La proteína Rb se puede encontrar en células en un complejo con MDM-2 y p53, lo que da como resultado una alta actividad de p53 y una actividad apoptótica mejorada (Xiao et al., 1995). Los niveles altos de E2F-1 activo no unido a Rb cambian la respuesta de p53 de la detención de G-1 a la apoptosis. Tanto Rb como MDM-2 están fosforilados e inhibidos por ciclina E-cdk2 (Figura 4). Cuando se activa p53, estimula la síntesis de la proteína p21, que inhibe la actividad de ciclina E-cdk2, y esta a su vez actúa sobre el complejo Rb-MDM-2 que promueve la actividad de p53 y la apoptosis. Después del daño del ADN, tanto la proteína MDM-2 como la proteína p53 son modificadas por la proteína quinasa ATM (Figura 4). Esto mejora la actividad de p53 de la misma manera que el complejo p53-MDM-2-Rb aumenta la función de p53 y es proapoptótico. Para una revisión reciente detallada del eje p53-Rb-E2F1, véase Yamasaki (2003).

Parte de la activación de la proteína p53 implica la fosforilación de la proteína p53 en las serinas ubicadas en los residuos 33 y 46 por la p38 MAP quinasa (Figura 5). Esta p38 MAP quinasa se activa por sí misma por fosforilación (regulada por la vía Ras-Raf-Mek-Erk) que puede ser revertida o inactivada por la fosfatasa Wip-1. Wip-1 es un gen que responde a p53 o regulado por p53 que forma un bucle autorregulador negativo y conecta las vías p53 y Ras (Takekawa et al., 2000) (Figura 5). Una proteína p53 activada regula positivamente la transcripción de la ubiquitina ligasa Siah-1 (Fiucci et al., 2004), que a su vez actúa para degradar la proteína beta-catenina (Iwai et al., 2004) (Figura 6). Los niveles de beta-catenina pueden regular el gen ARF p14 / 19, que a su vez regula negativamente MDM-2 y da como resultado niveles más altos de p53 (un ciclo de retroalimentación positiva) (Figura 6). Por tanto, Siah-1 conecta la vía Wnt-beta-catenina-APC con la vía p53. En algunos tipos de células, la proteína p53 induce la transcripción del gen PTEN (Figura 7). La proteína PTEN es una fosfatasa PIP-3. PIP-3 activa la cinasa AKT, que tiene varios sustratos proteicos antiapoptóticos, incluida la proteína MDM-2. La fosforilación da como resultado la translocación de MDM-2 al núcleo donde inactiva p53 (Figura 7). Esto conecta la vía de p53 con la vía de IGF-1-AKT y forma un circuito de retroalimentación positiva para mejorar la actividad de p53 y disminuir la actividad de AKT. Este bucle en la regulación de p53 también se ha revisado recientemente (Gottlieb et al., 2002). Estos bucles de retroalimentación positiva y negativa logran dos cosas: (1) modulan la actividad de p53 en la célula y (2) coordinan la actividad de p53 con otras vías de transducción de señales que regulan la entrada de la célula en el ciclo celular (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenina, IGF-1 y ciclina E-cdk2).

Hay dos circuitos autorreguladores adicionales de p53 que retroalimentan negativamente la función de p53. Uno de los genes sensibles a p53 más activos es el gen ciclina G. Se transcribe rápidamente a niveles elevados después de la activación de p53 en una amplia variedad de tipos de células (Okamoto y Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). La proteína ciclina G forma un complejo con la fosfatasa PP2A, que elimina un residuo de fosfato de MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (Figura 8), que se agrega a la proteína MDM-2 por una cdk quinasa (Zhang y Prives, 2001) (Figura 4). La fosforilación de MDM-2 por ciclina A / cdk2 inhibe su actividad, por lo que la ciclina G-PP2A fosfatasa mejora la actividad de MDM-2 e inhibe p53. Los ratones con el gen de ciclina G eliminado son viables (Kimura et al., 2001), y los fibroblastos de embriones de ratón nulos de ciclina G tienen niveles elevados de proteína p53 en ausencia de estrés (Okamoto et al., 2002), lo que demuestra que este circuito de retroalimentación es operativo in vivo y actúa sobre los niveles basales de p53 en una célula, no solo los niveles más altos de p53 activados después del estrés. El segundo ciclo de retroalimentación negativa involucra a un miembro de la familia p53 de factores de transcripción, que incluyen p53, p63 y p73 que están relacionados por estructura y función y han evolucionado a partir de un precursor común. Después de una respuesta al estrés, se activa el gen p53, que a su vez estimula la transcripción de un m-ARN empalmado particular del gen p73, llamado p73 delta N (Figura 9). Esto traduce una proteína p73 sin su dominio amino-terminal. Las tres de la familia de proteínas p53 tienen estructuras de dominio similares compuestas por un dominio de activación transcripcional N-terminal vinculado a un dominio central central que se une a una secuencia de ADN específica discutida anteriormente. Los tres factores de transcripción de la familia p53 reconocen la misma secuencia de ADN, aunque p53, p63 y p73 son capaces de iniciar distintos programas transcripcionales. Sin embargo, hay una gran cantidad de genes comunes que pueden ser regulados por las tres proteínas, como se revisó recientemente en Harms et al. (2004).Por tanto, cuando p53 activa la transcripción de p73 delta N, la proteína p73 delta N puede unirse a muchos de los genes regulados por p53, pero la ausencia de un dominio de transactivación hace que actúe como represor o competidor de la activación transcripcional de p53. De esta manera, se establece un circuito de retroalimentación negativa y la actividad de p53 disminuye (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (Figura 9). Por lo tanto, cinco de estos circuitos de retroalimentación positiva o negativa (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) involucran genes y proteínas que son miembros centrales de otras vías de transducción de señales, mientras que dos (ciclina G y p73 delta N) forman bucles de retroalimentación negativa directa.

Los bucles de retroalimentación negativa finales que se discutirán vienen en forma de ubiquitina ligasas. Sorprendentemente, parece haber tres actividades de ligasa de p53-ubiqutina diferentes (MDM-2, Cop-1 y Pirh-1), cada una de las cuales forma un bucle autorregulador que da como resultado una menor actividad de p53 (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (Figura 10). Cada gen es activado transcripcionalmente por p53. En la actualidad, no está claro por qué existe este nivel de redundancia. Varias posibilidades son que estos productos génicos se expresen o actúen de manera óptima en diferentes tipos de células o tejidos o incluso en diferentes etapas de desarrollo. Por ejemplo, el ratón inactivo MDM-2 es letal aproximadamente 6 días después de la fertilización justo en la implantación del blastocisto. Esto puede ser provocado por la hipoxia que debe ocurrir en esa etapa, activando p53 en ausencia de MDM-2 y provocando apoptosis. Congruente con esta interpretación es la observación de que un ratón p53, MDM-2 doble knockout es viable y nace tan normal como un ratón knockout p53 (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Por lo tanto, esto es consistente con la idea de que la proteína MDM-2 actúa sin una actividad de respaldo de ubiquitina ligasa en la etapa de blastocisto, pero estas otras proteínas podrían permitir una función más normal en etapas posteriores de desarrollo. Estas ideas ahora se pueden probar. También es posible que una o más de estas tres ubiquitina ligasas estén implicadas en el mantenimiento de los niveles de p53 en el estado basal o sin estrés, mientras que otras actúan sólo después de que se produce una p53 inducida por estrés. Las proteínas p53 activadas y p53 inducidas por estrés tienen modificaciones proteicas muy diferentes y el impacto de esto sobre la actividad de MDM-2, Cop-1 o Pirh-2 no está claro en la actualidad. Parece probable que cada una de estas tres ligasas de ubiquitina forme complejos de proteínas en la célula y las proteínas asociadas pueden diferir para cada una de estas ligasas, conectándolas a diferentes circuitos reguladores. En la actualidad, se sabe mucho sobre MDM-2 y se ha prestado relativamente poca atención al papel de Cop-1 y Pirh-2, que solo se han informado en la literatura en el último año aproximadamente. Además, muy recientemente se demostró que p53 es el sustrato de otra enzima ligasa de ubiquitina E3, topors (Rajendra et al., 2004). Queda por determinar si topors es también un objetivo transcripcional de p53 y, por lo tanto, debe agregarse a la creciente lista de proteínas que contribuyen al control autorregulador de la vía de p53. Los próximos años de estudio deberían abordar estas preguntas.

Como se mencionó anteriormente, muchos de los bucles reguladores involucran a MDM-2, destacando así el papel central de MDM-2 en el control de la actividad de p53. Un análisis genético de mutaciones de p53 y MDM-2 que bloquean este complejo proteico ha identificado residuos de aminoácidos críticos en cada proteína que son importantes para esta interacción de unión (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Se ha demostrado que estos mismos residuos de aminoácidos hacen estos contactos proteicos en la estructura cristalina del extremo amino de HDM-2 (la proteína humana) y un péptido del extremo amino de p53 (Kussie et al., 1996) . Los residuos de fenialanina 19, triptófano 23 y leucina 26 de p53 forman los principales contactos en la bolsa hidrófoba de MDM-2. La fosforilación de los residuos serina 20 y posiblemente serina 15 debería debilitar estos contactos, y los péptidos y fármacos que compiten con estos contactos bloquean el complejo p53 MDM-2 y promueven la apoptosis en las células (Klein y Vassilev, 2004). Por tanto, el complejo p53-MDM-2 y la actividad de la ubiquitina ligasa MDM-2 se han convertido en un importante objetivo farmacológico para algunos cánceres. En aproximadamente un tercio de los sarcomas humanos y en algunas leucemias y glioblastomas, el gen HDM-2 se ha amplificado y esta proteína se sobreexpresa. El gen p53 es de tipo salvaje y la proteína p53 aparentemente está inactiva, por lo que los fármacos que rompen el complejo p53-HDM-2 deberían activar p53. Además, muchos otros cánceres parecen expresar el producto del gen HDM-2 en niveles elevados incluso cuando el gen HDM-2 no está amplificado. En estos tipos de cánceres, el bloqueo de la actividad de HDM-2 o la liberación de p53 de este complejo bien podría inducir la apoptosis selectivamente en las células cancerosas. Esto también podría mejorar la actividad quimioterapéutica de algunos fármacos que activan p53.

Se prevé que el bucle autorregulador p53-MDM-2 establezca un oscilador con niveles de p53 y MDM-2 aumentando y disminuyendo con el tiempo y desfasados en la celda. Esto se ha demostrado en primer lugar midiendo los niveles de MDM-2 y p53 usando transferencias Western de proteínas de células en cultivo que experimentan una respuesta al estrés de p53 (Lev Bar-Or et al., 2000). Si bien las oscilaciones se observan y amortiguan con el tiempo, este experimento promedia las concentraciones de proteína de muchas células en cultivo que pueden estar desfasadas en sus oscilaciones, dando lugar a interferencias constructivas o destructivas. Por esta razón, se obtuvieron imágenes de las proteínas de fusión p53 y HDM2 marcadas con fluorescencia en células individuales para seguir los cambios en los niveles de p53 y HDM-2 en células que experimentan una respuesta al estrés de p53. Se observaron las esperadas oscilaciones fuera de fase y, sorprendentemente, el número de oscilaciones en una celda fue proporcional a la dosis de radiación administrada a estas células (Lahav et al., 2004). Esto sugiere que p53 puede medir la intensidad de una señal de estrés de forma digital (número de oscilaciones) y no de forma analógica (concentraciones de p53 más altas). Se han observado oscilaciones similares en otras rutas de transducción de señales que tienen bucles autorreguladores negativos, como la ruta NF-κ-B con las proteínas NF-κ-B e I-κ-B (Scott et al., 1993). Estas señales digitales resultantes de oscilaciones en la cantidad de factores de transcripción bien podrían dar como resultado un patrón de expresión génica periódica. Sin embargo, no está claro cómo las señales digitales a nivel del factor de transcripción se traducen en señales analógicas al nivel de la cantidad de ARNm producido por un gen. Estos experimentos conducen a la posibilidad de que diferentes números de oscilaciones, el tiempo o la longitud de onda de las oscilaciones o la amplitud de estas oscilaciones puedan afectar el patrón seleccionado de expresión génica y el resultado (detención del ciclo celular, apoptosis o senescencia) del p53. respuesta.

¿Por qué hay tantos ciclos de retroalimentación en la vía p53? Hay muchas respuestas para esta pregunta. Es posible que todos los mecanismos no estén activos en la misma célula o tipo de tejido o en las mismas etapas durante el desarrollo. Los bucles de retroalimentación del tipo descrito aquí proporcionan un medio para conectar la vía p53 con otras vías de transducción de señales y coordinar las señales celulares para el crecimiento y la división. Las redundancias en un sistema a veces pueden prevenir errores y un sistema de respaldo reduce el fenotipo de mutaciones. Por otro lado, no todos los bucles de retroalimentación mostrados en las Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 pueden resistir la prueba del tiempo y la experimentación adicional. Muchas de estas vías se han dilucidado mediante experimentos llevados a cabo con células cancerosas en cultivo que tienen mutaciones que alteran estas vías. Incluso las células normales en cultivo o ratones knockout (debido a la acomodación a la mutación) pueden no reflejar todas las condiciones que ocurren en células y órganos normales in vivo. Es particularmente difícil probar que una proteína quinasa o fosfatasa específica actúa sobre un sustrato específico in vivo y tiene un resultado que puede medirse cuantitativamente. Por lo tanto, necesitamos continuar probando y desafiando las funciones y vías que creemos operan en una célula. Sin embargo, estos constructos, que se muestran en las Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, son útiles para formular hipótesis y probar ideas que seguramente conducirán a nuevos conocimientos sobre la naturaleza de los cánceres y el diseño de fármacos y agentes que matan selectivamente las células cancerosas.