Cuando comenzó la segunda invasión persa de Grecia en 481 a. C., Leonidas fue elegido para liderar las fuerzas griegas combinadas, tanto por la reputación de los espartanos como militar superior reino, y debido a su propia destreza como general. Se dice que el rey visitó el Oráculo en Delfos, que fue consultado sobre importantes asuntos de estado en toda la Antigua Grecia, y el Oráculo pronunció un gran verso que esencialmente le decía que debía dar su vida para evitar que su reino fuera devastado por Persia.
En agosto de 480 a. C., Leónidas marchó para encontrarse con el ejército del rey persa Jerjes en las Termópilas, un estrecho pasaje costero que se encontraba en la ruta de los persas hacia el interior. Tenía con él solo 300 soldados espartanos de élite y 900 esclavos, a los que agregó mientras marchaba a través del país a través de otras ciudades-estado, terminando con un ejército total de entre 4.000 y 7.000 hombres. Se han presentado varias explicaciones de por qué la fuerza era tan pequeña; Herodoto teorizó que los espartanos marcharon directamente para que se los viera sin mostrar miedo, con la expectativa de que se reuniría un ejército más grande y lo seguiría poco después, pero los historiadores modernos creen que las luchas internas o incluso el hecho de que se estaban celebrando los Juegos Olímpicos. en ese momento podría haber sido el culpable.
El ejército persa al que se enfrentaron era enorme en número. La estimación de Herodoto de dos millones de hombres ha sido refutada desde entonces, pero la cifra era de al menos 70.000 y posiblemente hasta 300.000. Siguió un estancamiento de cuatro días, luego los persas atacaron el quinto día. Durante dos días, los griegos detuvieron a los persas y mataron a unos 10.000 de sus hombres, incluidos dos de los hermanos del rey Asuero. El séptimo día, un traidor llamado Efialtes se puso en contacto con el general persa Hydarnes y le mostró un camino oculto que podía tomar para ponerse detrás de los griegos. Sabiendo que ahora estaba flanqueado, Leonidas envió a todas las tropas griegas, eligiendo permanecer en el paso con sus 300 espartanos y los esclavos, 400 tebanos y 700 tespios.
Herodoto registró que Leonidas envió a los hombres a asegurarse de que vivirían para luchar otro día y ser útiles en una futura batalla contra los persas, y los espartanos se quedaron tanto para proteger la fuga de los griegos como porque nunca podrían abandonar su posición en el campo de batalla. Se suponía que los tespios habían sido enviados con los otros griegos, pero se quedaron atrás por su propia voluntad.
Según los informes, Jerjes se ofreció a perdonar la vida de los espartanos si entregaban las armas, a lo que Leonidas respondió » ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(ven y tómalos). Los hombres lucharon en una última y amarga batalla contra los persas, y todos murieron excepto los 400 tebanos, que se rindieron a los persas sin luchar. Después de que Leonidas fue asesinado, los espartanos lucharon para recuperar su cuerpo y evitar que los persas lo profanaran. Leonidas tenía aproximadamente 60 años al momento de su muerte, y fue sucedido por su hijo, Pleistarchus.