A p53 útvonal: pozitív és negatív visszacsatolási hurok

Az irodalom számos vizsgálata 10 pozitív vagy negatív visszacsatolási hurkot azonosított a p53 útvonalban (lásd a 3., 4., 5., 6., 7, 8, 9 és 10). Ezen hurkok mindegyike létrehoz egy olyan fehérjékből álló áramkört, amelyek aktivitását vagy szintézis sebességét a p53 aktiválása befolyásolja, ez pedig a p53 aktivitásának megváltozását eredményezi egy sejtben. Ezek közül hét negatív visszacsatolási hurok, amely modulálja a p53 aktivitását (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, ciklin G, Wip-1 és Siah-1), három pedig pozitív visszacsatoló hurok (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF és Rb), amelyek modulálják a p53 aktivitását. Mindezek a hálózatok vagy áramkörök autoregulatívak, mivel vagy a transzkripciós szinten p53-aktivitás indukálják őket, a p53 transzkripcióval represszálják őket (p14 / 19 ARF, 3. ábra), vagy a p53-indukált fehérjék szabályozzák őket. Ezen visszacsatoló hurkok közül hat működik az MDM-2-n keresztül (MDM-2, ciklin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT és Rb) a p53 aktivitásának modulálására.

Izgalmas megállapítás, hogy a p53 útvonal szorosan kapcsolódik más jelátvitelhez olyan utak, amelyek jelentős szerepet játszanak a rák kialakulásában. Az első vizsgált kapcsolatok egyike magában foglalja a p14 / p19ARF-et és az MDM-2-t. A p14 / 19 ARF fehérje kötődik az MDM-2 fehérjéhez és modulálja az ubiquitin ligáz aktivitását, növelve a p53 fehérje szintjét (Honda és Yasuda, 1999) (3. ábra). A p14 / 19 ARF gén transzkripcióját pozitívan szabályozza az E2F-1 (Zhu et al., 1999) és a béta-catenin (Damalas et al., 2001), és maga a p53 szabályozza negatívan. Ezenkívül a p14 / 19 ARF fehérje szintjét növeli a Ras és Myc aktivitás egy sejtben (3. ábra). A p53 p14 / p19 ARF általi szabályozásának bonyolultságát nemrégiben felülvizsgálták (Lowe és Sherr, 2003). A p14 / 19 ARF-MDM-2 komplexek gyakran a sejt magjában lokalizálódnak a p14 / p19 ARF-ben jelenlévő nukleoláris lokalizációs jelek miatt. A nukleolus a riboszomális biogenezis helyszíne, és maga a p14 / 19 ARF-aktivitás megváltoztathatja a riboszomális RNS-prekurzor érett riboszomális alegységekké történő RNS-feldolgozásának sebességét (Sugimoto et al., 2003). Így a p14 / 19 ARF az MDM-2 és a p53 szintjének szabályozásával és ennek a riboszomális biogenezissel való összehangolásával fontos szerepet játszik a sejtciklus-szabályozásban. Ezt nemrégiben megerősítette az a demonstráció, hogy a p14 / 19 ARF fehérje képes szabályozni a Myc aktivitást (és ezért a sejtek méretét is) (Datta et al., 2004). A nukleolusban lévő MDM-2 azonban nem passzív entitás. Kimutatták, hogy az MDM-2 fehérje specifikusan kötődik három nagy riboszomális alegység fehérjéhez, az L5, L11 és L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), és az L5 (Dai és Lu, 2004) vagy az L11 (Lohrum és mtsai, 2003; Zhang és mtsai, 2003) MDM-2-hez való kötődése csökkenti ubiquitin ligáz aktivitását. Ezenkívül az MDM-2 gyűrűs ujj doménje specifikusan kötődik a nagy riboszomális RNS alegységben található RNS szekvenciához (Elenbaas et al., 1996). Bár ezek a megfigyelések rámutatnak az MDM-2 és a p14 / 19 ARF központi szerepére a riboszóma biogenezisének és a sejtciklus szabályozásában, nem értjük, hogy ezek a megfigyelések hogyan alkotják ezt a szabályozási kört.

Az Rb fehérje megtalálható az MDM-2 és p53 komplexben lévő sejtekben, ami magas p53 aktivitást és fokozott apoptotikus aktivitást eredményez (Xiao és mtsai, 1995). Az Rb-hez nem kötött aktív E2F-1 magas szintje a p53 választ G-1 leállításról apoptózisra kapcsolja. Az Rb és az MDM-2 egyaránt foszforilálódik és gátolja a ciklin E-cdk2 (4. ábra). Amikor a p53 aktiválódik, stimulálja a p21 fehérje szintézisét, amely gátolja a ciklin E-cdk2 aktivitását, és ez pedig az Rb-MDM-2 komplexre hat, amely elősegíti a p53 aktivitását és az apoptózist. DNS károsodás után az MDM-2 fehérjét és a p53 fehérjét is módosítja az ATM protein kináz (4. ábra). Ez ugyanúgy fokozza a p53 aktivitását, mint a p53-MDM-2-Rb komplex növeli a p53 funkcióját és proapoptotikus. A p53-Rb-E2F1 tengely részletes közelmúltbeli áttekintése érdekében lásd Yamasaki (2003).

A p53 fehérje aktivációjának egy része magában foglalja a p53 fehérje foszforilezését a 33. és 46. szermaradékban található szerineken. a p38 MAP kináz (5. ábra). Ez a p38 MAP kináz maga is aktiválódik a foszforilezéssel (amelyet a Ras-Raf-Mek-Erk út szabályoz), amelyet a Wip-1 foszfatáz megfordíthat vagy inaktiválhat. A Wip-1 egy p53-ra reagáló vagy p53-szabályozott gén, amely negatív autoregulációs hurkot alkot, és összeköti a p53 és Ras útvonalakat (Takekawa és mtsai., 2000) (5. ábra). Az aktivált p53 fehérje pozitívan szabályozza a Siah-1 ubiquitin ligáz transzkripcióját (Fiucci és mtsai, 2004), amely viszont a béta-katenin fehérje lebontására szolgál (Iwai et al., 2004) (6. ábra). A béta-katenin szint szabályozhatja a p14 / 19 ARF gént, amely viszont negatívan szabályozza az MDM-2-t, és magasabb p53 szintet eredményez (pozitív visszacsatolási hurok) (6. ábra). A Siah-1 így összeköti a Wnt-béta-katenin-APC útvonalat a p53 útvonallal. Egyes sejttípusokban a p53 fehérje indukálja a PTEN gén transzkripcióját (7. ábra). A PTEN fehérje egy PIP-3 foszfatáz. A PIP-3 aktiválja az AKT kinázt, amelynek számos antiapoptotikus fehérje szubsztrátja van, beleértve az MDM-2 fehérjét. A foszforilezés az MDM-2 transzlokációját eredményezi a sejtmagba, ahol inaktiválja a p53-at (7. ábra). Ez összeköti a p53 útvonalat az IGF-1-AKT útvonallal, és pozitív visszacsatolási ciklust képez a fokozott p53 aktivitás és a csökkent AKT aktivitás érdekében. A p53 szabályozásának ezt a körét a közelmúltban is felülvizsgálták (Gottlieb et al., 2002). Ezek a pozitív és negatív visszacsatolási hurkok két dolgot érnek el: (1) modulálják a p53 aktivitását a sejtben, és (2) összehangolják a p53 aktivitását más olyan jelátviteli utakkal, amelyek szabályozzák a sejt belépését a sejtciklusba (Rb-E2F-1, myc, Ras, béta-katenin, IGF-1 és ciklin E-cdk2 aktivitások).

Két további p53 autoregulációs áramkör létezik, amelyek negatívan reagálnak a p53 működésére. A p53-ra reagáló gének közül az egyik legaktívabb a ciklin G-gén. Gyorsan átíródik magas szintre a p53 aktiválása után sokféle sejttípusban (Okamoto és Beach, 1994; Zauberman és mtsai, 1995; Bates és mtsai, 1996; Yardley és mtsai, 1998). A ciklin G fehérje komplexet alkot a PP2A foszfatázzal, amely eltávolítja az MDM-2 foszfátmaradékát (Okamoto et al., 2002) (8. ábra), amelyet egy cdk kináz (Zhang és munkatársai) ad hozzá az MDM-2 fehérjéhez. Prives, 2001) (4. ábra). Az MDM-2 ciklin A / cdk2 általi foszforilezése gátolja aktivitását, így a ciklin G-PP2A foszfatáz fokozza az MDM-2 aktivitását és gátolja a p53-at. A kiütött ciklin G génnel rendelkező egerek életképesek (Kimura és mtsai., 2001), és a ciklin G null egér embrió fibroblasztjainak stressz nélkül megemelkedett a p53 fehérje szintje (Okamoto és mtsai, 2002), bizonyítva, hogy ez a visszacsatolási hurok in vivo működik, és a sejtben a p53 alapszintjére hat, nemcsak a stressz utáni magasabb p53 aktivált szintekre. A második negatív visszacsatolási hurok a p53 transzkripciós faktorok családjának egy tagját foglalja magában, amelyek magukban foglalják a p53, p63 és p73 szerkezetét és funkcióját, és közös prekurzorból fejlődtek ki. A stresszválasz után a p53 gén aktiválódik, ami viszont serkenti a p73 génből egy speciális spliccelt m-RNS, az úgynevezett p73 delta N transzkripcióját (9. ábra). Ez egy p73 fehérjét fordít le aminoterminális doménje nélkül. A p53 fehérjecsalád mindhárom hasonló doménstruktúrával rendelkezik, amely egy N-terminális transzkripciós aktivációs doménből áll, amely egy központi mag-doménhez kapcsolódik, amely a fent tárgyalt specifikus DNS-szekvenciához kötődik. A p53 család transzkripciós faktorai mindhárom ugyanazt a DNS-szekvenciát ismerik fel, annak ellenére, hogy a p53, p63 és p73 képesek különálló transzkripciós programok elindítására. Számos olyan közös gén létezik, amelyeket mindhárom fehérje szabályozhat, amint azt a közelmúltban áttekintették Harms et al. (2004).Tehát, amikor a p53 aktiválja a p73 delta N transzkripcióját, a p73 delta N fehérje sok p53-szabályozott génhez képes kötődni, de a transzaktivációs domén hiánya miatt a p53 transzkripciós aktivációjának represszoraként vagy versenytársaként működik. Ily módon negatív visszacsatolási hurok jön létre és a p53 aktivitása csökken (Grob és mtsai, 2001; Kartasheva és mtsai, 2002) (9. ábra). Így ezek közül a pozitív vagy negatív visszacsatoló áramkörök közül öt (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) olyan géneket és fehérjéket tartalmaz, amelyek más jelátviteli utak központi tagjai, míg kettő (ciklin G és p73 delta) N) közvetlen negatív visszacsatolási hurkokat alkotnak.

A megvitatandó végleges negatív visszacsatolási hurkok ubiquitin ligázok formájában jönnek létre. Meglepő módon úgy tűnik, hogy három különböző p53-ubiqutin ligáz aktivitás van (MDM-2, Cop-1 és Pirh-1), amelyek mindegyike autoregulációs hurkot képez, amely alacsonyabb p53 aktivitást eredményez (Leng et al., 2003; Dornan et al. , 2004) (10. ábra). Minden gént transzkripciósan aktivál a p53. Jelenleg nem világos, hogy miért van ilyen mértékű elbocsátás. Számos lehetőség van arra, hogy ezek a géntermékek különböző sejttípusokban vagy szövettípusokban vagy akár a fejlődés különböző szakaszaiban expresszálódnak vagy működnek optimálisan. Például az MDM-2 knockout egér a megtermékenyítés után körülbelül 6 nappal halálos, csak a blasztociszta beültetésénél. Ezt kiválthatja az a hypoxia, amelynek ebben a szakaszban kell bekövetkeznie, MDM-2 hiányában aktiválja a p53-at és apoptózist okoz. Ezzel az értelmezéssel összhangban van az a megfigyelés, miszerint a p53, MDM-2 kettős knockout egér életképes, és ugyanolyan normálisan születik, mint egy p53 knockout egér (Jones és mtsai., 1995; Montes de Oca Luna és mtsai., 1995). Ez tehát összhangban áll azzal az elképzeléssel, hogy az MDM-2 fehérje tartalék ubiquitin ligáz aktivitás nélkül működik a blasztociszta stádiumban, de ezek a más fehérjék normálisabb működést tehetnek lehetővé a fejlődés későbbi szakaszaiban. Ezek az ötletek most tesztelhetők. Az is lehetséges, hogy e három ubiquitin ligáz közül egy vagy több részt vesz a p53 szint fenntartásában nem hangsúlyos vagy bazális állapotban, míg mások csak egy stressz okozta p53 termelődése után hatnak. Az aktivált p53 és a stressz által indukált p53 fehérjék nagyon eltérő fehérje-módosulatokkal rendelkeznek, és ennek hatása az MDM-2, Cop-1 vagy Pirh-2 aktivitására jelenleg nem világos. Valószínűnek tűnik, hogy mind a három ubiquitin-ligáz fehérjekomplexeket képez a sejtben, és a kapcsolódó fehérjék ezen ligázok mindegyikénél nagyon eltérőek lehetnek, összekapcsolva őket különböző szabályozó áramkörökkel. Jelenleg nagyon sokat tudni az MDM-2-ről, és viszonylag kevés hangsúlyt fektettek a Cop-1 és a Pirh-2 szerepére, amelyekről az irodalomban csak az elmúlt egy évben számoltak be. Ezenkívül a közelmúltban kimutatták, hogy a p53 egy másik E3 ubiquitin ligáz enzim, a toporok szubsztrátja (Rajendra et al., 2004). Meg kell még határozni, hogy a toporok is a p53 transzkripciós célpontjai-e, és ezért fel kell venni őket a p53 útvonal automatikus szabályozásához hozzájáruló fehérjék növekvő listájára. A következő néhány év tanulmányának ezeket a kérdéseket kell megválaszolnia.

Amint azt fentebb említettük, a szabályozási körök közül sok az MDM-2-t foglalja magában, kiemelve ezzel az MDM-2 központi szerepét a p53 aktivitásának szabályozásában. A p53 és MDM-2 mutációk genetikai elemzése, amelyek blokkolják ezt a fehérjekomplexumot, minden egyes fehérjében kritikus aminosavmaradékokat azonosítottak, amelyek fontosak ehhez a kötési interakcióhoz (Lin és mtsai., 1994; Freedman és mtsai., 1997). Kimutatták, hogy ugyanazok az aminosavmaradékok érintkeznek a fehérjével a HDM-2 aminosav-végének (az emberi fehérje) és a p53 aminosav-terminális peptidjének kristályszerkezetében (Kussie et al., 1996). . A p53 19 fenilalanin, 23 triptofán és 26 leucin maradékai alkotják a fő érintkezőket az MDM-2 hidrofób zsebében. A szerin 20 és esetleg a 15 szerin maradékok foszforilezésének gyengítenie kell ezeket az érintkezéseket, az ezekkel a kontaktusokkal versengő peptidek és gyógyszerek blokkolják a p53 MDM-2 komplexet és elősegítik az apoptózist a sejtekben (Klein és Vassilev, 2004). Így a p53-MDM-2 komplex és az MDM-2 ubiquitin ligáz aktivitás egyes rákos megbetegedések egyik fő célpontjává vált. Az emberi szarkómák körülbelül egyharmadában, valamint egyes leukémiákban és glioblasztómákban a HDM-2 gént amplifikálták, és ez a fehérje túlexpresszálódott. A p53 gén vad típusú és a p53 fehérje látszólag inaktív, ezért a p53-HDM-2 komplexet megbontó gyógyszereknek aktiválniuk kell a p53-at. Ezenkívül sok más rák úgy tűnik, hogy magas szinten expresszálja a HDM-2 génterméket, még akkor is, ha a HDM-2 gént nem amplifikálják. Az ilyen típusú rákokban a HDM-2 aktivitás blokkolása vagy a p53 felszabadítása ebből a komplexből jól kiválthatja az apoptózist a rákos sejtekben. Ez fokozhatja egyes olyan gyógyszerek kemoterápiás aktivitását is, amelyek aktiválják a p53-at.

Az előrejelzések szerint a p53-MDM-2 hurok létrehoz egy oszcillátort, amelynek p53 és MDM-2 szintje növekszik és csökken az idő múlásával és a cellán kívüli fázison kívül. Ezt először az MDM-2 és a p53 szintjének mérésével mutattuk ki, p53 stresszválaszon átesett tenyészetekből származó sejtekből származó fehérjék Western-blotjaival (Lev Bar-Or et al., 2000). Míg az oszcillációk figyelhetők meg és csillapodnak az idő múlásával, ez a kísérlet a tenyészet számos olyan sejtjének fehérjekoncentrációját átlagolja, amelyek rezgésük fázisán kívül eshetnek, ami konstruktív vagy destruktív interferenciát eredményez. Emiatt fluoreszcensen jelölt p53 és HDM2 fúziós fehérjéket képeztek le az egyes sejtekben, hogy kövessék a p53 és HDM-2 szint változását a p53 stresszválaszon áteső sejtekben. Megfigyelték a fázison kívüli várható ingadozásokat, és meglepő módon a sejtben lévő rezgések száma arányos volt az ezeknek a sejteknek adott sugárzási dózissal (Lahav et al., 2004). Ez arra utal, hogy a p53 digitális módon (a rezgések száma) és nem analóg módon (magasabb p53 koncentráció) mérheti a stressz jel intenzitását. Hasonló rezgéseket figyeltek meg más olyan jelátviteli utakban, amelyek negatív autoregulációs hurokkal rendelkeznek, például az NF-κ-B útvonalon az NF-κ-B és I-κ-B fehérjékkel (Scott és mtsai., 1993). Ezek a transzkripciós faktorok mennyiségének ingadozásából eredő digitális jelek a periodikus génexpresszió mintázatát eredményezhetik. Az azonban továbbra sem tisztázott, hogy a transzkripciós faktor szintjén milyen digitális jeleket alakítunk át analóg jelekké egy gén által termelt mRNS mennyiségének szintjén. Ezek a kísérletek arra a lehetőségre vezetnek, hogy a különböző oszcillációk száma, az oszcillációk időzítése vagy hullámhossza, vagy ezen rezgések amplitúdója befolyásolhatja a génexpresszió kiválasztott mintázatát és a p53 kimenetelét (sejtciklus leállás, apoptózis vagy öregedés) válasz.

Miért van olyan sok visszacsatolási hurok a p53 útvonalon? Erre a kérdésre sok válasz adható. Előfordulhat, hogy az összes mechanizmus nem aktív ugyanabban a sejt- vagy szövettípusban, vagy a fejlődés során ugyanazon szakaszokban. Az itt leírt típusú visszacsatolási hurkok lehetőséget nyújtanak arra, hogy összekapcsolják a p53 útvonalat más jelátviteli utakkal, és összehangolják a sejtjeleket a növekedés és az osztódás szempontjából. A rendszer redundanciái időnként megelőzhetik a hibákat, a tartalék rendszer pedig csökkenti a mutációk fenotípusát. Másrészt a 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9. és 10. ábrán bemutatott visszacsatolási hurok nem mindegyike állhatja ki az idő és a további kísérletezés próbáját. Ezen utak közül sokat olyan rákos sejtekkel végzett kísérletekkel derítettek ki, amelyek olyan mutációkkal rendelkeznek, amelyek megváltoztatják ezeket az utakat. Még a tenyészetekben lévő normál sejtek vagy a knockout egerek (a mutációhoz való alkalmazkodás miatt) nem feltétlenül tükrözik a normális sejtekben és szervekben in vivo előforduló összes állapotot. Különösen nehéz bizonyítani, hogy egy specifikus protein-kináz vagy foszfatáz in vivo egy adott szubsztrátra hat, és kvantitatív módon mérhető eredménye van. Így folytatnunk kell a sejtekben működő funkciók és útvonalak tesztelését és megtámadását. Ezek a 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9. és 10. ábrán bemutatott konstrukciók azonban hasznosak olyan hipotézisek megfogalmazásában és olyan ötletek tesztelésében, amelyek minden bizonnyal újszerű betekintést eredményeznek a rákos megbetegedések természetébe és a gyógyszerek tervezésébe. szerek, amelyek szelektíven elpusztítják a rákos sejteket.