Amikor Kr. U. 481-ben megkezdődött a második perzsa invázió, Leonidast választották az egyesített görög erők vezetésére, mindkettő a spártaiak kiváló katonai hírneve miatt királyságát, és saját tábornoki képessége miatt. Azt mondják, hogy a király meglátogatta az Oracle-t Delphiben, amelyet az ókori Görögország egész területén fontos állami kérdésekről konzultáltak, és az Oracle nagy verset adott le, amely lényegében azt mondta neki, hogy életét el kell adnia, hogy megakadályozza királyságának pazarlását. Perzsia.
Kr. e. 480 augusztusában Leonidas kivonult, hogy találkozzon Xerxes perzsa király seregével a Thermopylae-nál, egy keskeny parti folyosón, amely a perzsák szárazföldi útvonalán feküdt. Mindössze 300 elit spártai katona és 900 rabszolga volt nála, amihez hozzátette, amikor más városállamokon keresztül országszerte haladt, és összesen 4000 és 7000 ember közötti hadsereg lett. Különböző magyarázatokat hoztak fel arra vonatkozóan, hogy miért volt ilyen kicsi az erő; Herodotosz elmélete szerint a spártaiak egyenesen vonultak ki, így láthatóan nem mutatnak félelmet, azzal a várakozással, hogy egy nagyobb hadsereget kell összegyűjteni és hamarosan követni fogják, de a modern történészek úgy vélik, hogy a belső viszályok, vagy akár az a tény, hogy az olimpiai játékokat tartják abban az időben lehetett a hibás.
A perzsa hadsereg, amellyel szembesültek, hatalmas volt. Herodotos kétmillió emberre vonatkozó becslését azóta lebontották, de ez a szám legalább 70 000, esetleg 300 000 volt. Négy napos patthelyzet következett, majd az ötödik napon a perzsák támadtak. Két napig a görögök visszatartották a perzsákat, mintegy 10 000 emberüket megölték, köztük Xerxes király két testvérét. A hetedik napon egy Ephialtes nevű áruló felvette a kapcsolatot Hydarnes perzsa tábornokkal, és megmutatott egy rejtett utat, amelyen haladhatott a görögök mögé. Tudván, hogy mostanra már túl van, Leonidas elküldte az összes görög csapatot, és úgy döntött, hogy a spanyolokkal és a rabszolgákkal, a 400 tebánnal és a 700 theszpussal a hágóban marad.
Herodotus feljegyezte, hogy Leonidas elküldte az embereket biztosítsák, hogy még egy napig éljenek, és hasznosak lehessenek a perzsák elleni jövőbeni csatában, és a spártaiak mind a görögök menekülésének védelmében, mind pedig azért, mert soha nem hagyhatták el helyzetüket a csatatéren. A thespiaiakat állítólag elküldték a többi göröggel, de saját akaratukból maradtak.
Xerxes állítólag felajánlotta, hogy megkíméli a spártaiak életét, ha feladják fegyvereiket, erre Leonidas válaszolt ” ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(gyere és vedd el őket). A férfiak ezután keserű utolsó kiállással küzdöttek a perzsák ellen, és mindet megölték, kivéve a 400 tebánt, akik harc nélkül adták meg magukat a perzsáknak. Miután Leonidast megölték, a spártaiak harcoltak a visszaszerzésért. testét, és megakadályozzák, hogy a perzsák meggyalázzák. Leonidas halálakor körülbelül 60 éves volt, őt fia, Pleistarchus követte.