Il percorso p53: cicli di feedback positivi e negativi

Numerosi studi in letteratura hanno identificato 10 circuiti di feedback positivi o negativi nel percorso p53 (vedere Figure 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10). Ciascuno di questi anelli crea un circuito composto da proteine le cui attività o velocità di sintesi sono influenzate dall’attivazione di p53, e questo a sua volta provoca l’alterazione dell’attività di p53 in una cellula. Di questi, sette sono loop di feedback negativi che modulano l’attività di p53 verso il basso (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyclin G, Wip-1 e Siah-1) e tre sono loop di feedback positivi (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF e Rb) che modulano l’attività di p53. Tutte queste reti o circuiti sono autoregolatori in quanto sono indotte dall’attività di p53 a livello trascrizionale, repressa trascrizionalmente da p53 (p14 / 19 ARF, Figura 3) o sono regolate da proteine indotte da p53. Sei di questi circuiti di feedback agiscono tramite MDM-2 (MDM-2, cyclin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT e Rb) per modulare l’attività di p53.

Una scoperta interessante è che il percorso p53 è intimamente collegato ad altre trasduzioni del segnale percorsi che svolgono un ruolo significativo nell’origine del cancro. Una delle prime connessioni studiate coinvolge p14 / p19ARF e MDM-2. La proteina p14 / 19 ARF si lega alla proteina MDM-2 e modula la sua attività di ubiquitina ligasi, aumentando i livelli della proteina p53 (Honda e Yasuda, 1999) (Figura 3). La trascrizione del gene p14 / 19 ARF è regolata positivamente da E2F-1 (Zhu et al., 1999) e beta-catenina (Damalas et al., 2001) e regolata negativamente dalla stessa p53. Inoltre, i livelli della proteina p14 / 19 ARF sono aumentati dalle attività di Ras e Myc in una cellula (Figura 3). La complessità della regolazione di p53 da p14 / p19 ARF è stata recentemente rivista (Lowe e Sherr, 2003). I complessi p14 / 19 ARF-MDM-2 sono spesso localizzati nel nucleolo della cellula a causa dei segnali di localizzazione nucleolare presenti all’interno di p14 / p19 ARF. Il nucleolo è il sito della biogenesi ribosomiale e l’attività stessa di p14 / 19 ARF può alterare la velocità di elaborazione dell’RNA del precursore dell’RNA ribosomiale in subunità ribosomiali mature (Sugimoto et al., 2003). Pertanto, p14 / 19 ARF controllando i livelli di MDM-2 e p53 e coordinando questo con la biogenesi ribosomiale gioca un ruolo importante nella regolazione del ciclo cellulare. Ciò è stato recentemente rafforzato dalla dimostrazione che la proteina p14 / 19 ARF può regolare anche l’attività di Myc (e quindi la dimensione delle cellule) (Datta et al., 2004). L’MDM-2 nel nucleolo non è, tuttavia, un’entità passiva. È stato dimostrato che la proteina MDM-2 si lega specificamente a tre grandi proteine della subunità ribosomiale L5, L11 e L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), e il legame di L5 (Dai e Lu, 2004) o L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) a MDM-2 riduce la sua attività di ubiquitina ligasi. Inoltre, il dominio del dito anulare di MDM-2 si lega specificamente a una sequenza di RNA che si trova nella grande subunità dell’RNA ribosomiale (Elenbaas et al., 1996). Mentre tutte queste osservazioni indicano un ruolo centrale per MDM-2 e p14 / 19 ARF nella regolazione della biogenesi dei ribosomi e del ciclo cellulare, non capiamo come queste osservazioni si uniscano per formare questo ciclo regolatorio.

La proteina Rb può essere trovata nelle cellule in un complesso con MDM-2 e p53, con conseguente elevata attività di p53 e maggiore attività apoptotica (Xiao et al., 1995). Alti livelli di E2F-1 attivo non legato a Rb cambiano la risposta di p53 dall’arresto G-1 all’apoptosi. Sia Rb che MDM-2 sono fosforilati e inibiti dalla ciclina E-cdk2 (Figura 4). Quando p53 è attivato, stimola la sintesi della proteina p21, che inibisce l’attività della ciclina E-cdk2, e questa a sua volta agisce sul complesso Rb-MDM-2 che promuove l’attività di p53 e l’apoptosi. Dopo il danno al DNA, sia la proteina MDM-2 che la proteina p53 vengono modificate dalla protein chinasi ATM (Figura 4). Ciò migliora l’attività di p53 nello stesso modo in cui il complesso p53-MDM-2-Rb aumenta la funzione di p53 ed è proapoptotico. Per una recente revisione dettagliata dell’asse p53-Rb-E2F1 vedere Yamasaki (2003).

Parte dell’attivazione della proteina p53 coinvolge la fosforilazione della proteina p53 alle serine situate ai residui 33 e 46 da la p38 MAP chinasi (Figura 5). Questa chinasi p38 MAP è essa stessa attivata dalla fosforilazione (regolata dalla via Ras-Raf-Mek-Erk) che può essere invertita o inattivata dalla fosfatasi Wip-1. Wip-1 è un gene p53-responsivo o regolato da p53 che forma un ciclo autoregolatorio negativo e collega le vie p53 e Ras (Takekawa et al., 2000) (Figura 5). Una proteina p53 attivata regola positivamente la trascrizione dell’ubiquitina ligasi Siah-1 (Fiucci et al., 2004), che a sua volta agisce per degradare la proteina beta-catenina (Iwai et al., 2004) (Figura 6). I livelli di beta-catenina possono regolare il gene p14 / 19 ARF, che a sua volta regola negativamente MDM-2 e si traduce in livelli di p53 più elevati (un ciclo di feedback positivo) (Figura 6). Siah-1 collega così la via Wnt-beta-catenina-APC alla via p53. In alcuni tipi di cellule, la proteina p53 induce la trascrizione del gene PTEN (Figura 7). La proteina PTEN è una fosfatasi PIP-3. PIP-3 attiva la chinasi AKT, che ha un numero di substrati proteici antiapoptotici inclusa la proteina MDM-2. La fosforilazione provoca la traslocazione di MDM-2 nel nucleo dove inattiva p53 (Figura 7). Questo collega il percorso p53 con il percorso IGF-1-AKT e forma un ciclo di feedback positivo per una maggiore attività di p53 e una diminuzione dell’attività AKT. Anche questo anello nella regolazione della p53 è stato recentemente rivisto (Gottlieb et al., 2002). Questi circuiti di feedback positivi e negativi realizzano due cose: (1) modulano l’attività di p53 nella cellula e (2) coordinano l’attività di p53 con altre vie di trasduzione del segnale che regolano l’ingresso della cellula nel ciclo cellulare (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenina, IGF-1 e cyclin E-cdk2).

Ci sono due circuiti autoregolatori di p53 aggiuntivi che feedback negativamente sulla funzione di p53. Uno dei geni più attivi che rispondono a p53 è il gene della ciclina G. Viene rapidamente trascritto a livelli elevati dopo l’attivazione di p53 in un’ampia varietà di tipi di cellule (Okamoto e Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). La proteina ciclina G forma un complesso con la fosfatasi PP2A, che rimuove un residuo di fosfato da MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (Figura 8), che viene aggiunto alla proteina MDM-2 da una chinasi cdk (Zhang e Prives, 2001) (Figura 4). La fosforilazione di MDM-2 da parte della ciclina A / cdk2 inibisce la sua attività, quindi la fosfatasi della ciclina G-PP2A aumenta l’attività dell’MDM-2 e inibisce la p53. I topi con il gene della ciclina G eliminato sono vitali (Kimura et al., 2001) e i fibroblasti di embrione di topo nullo di ciclina G hanno livelli elevati di proteina p53 in assenza di stress (Okamoto et al., 2002), dimostrando che questo ciclo di feedback è operativo in vivo e agisce sui livelli basali di p53 in una cellula non solo sui livelli più alti attivati di p53 dopo stress. Il secondo ciclo di feedback negativo coinvolge un membro della famiglia di fattori di trascrizione p53, che includono p53, p63 e p73 che sono correlati per struttura e funzione e si sono evoluti da un precursore comune. Dopo una risposta allo stress, viene attivato il gene p53, che a sua volta stimola la trascrizione di un particolare m-RNA giuntato dal gene p73, chiamato p73 delta N (Figura 9). Questo traduce una proteina p73 senza il suo dominio ammino-terminale. Tutte e tre le proteine della famiglia p53 hanno strutture di dominio simili composte da un dominio di attivazione trascrizionale N-terminale collegato a un dominio centrale centrale che si lega a una specifica sequenza di DNA discussa sopra. Tutti e tre i fattori di trascrizione della famiglia p53 riconoscono la stessa sequenza di DNA, anche se p53, p63 e p73 sono in grado di avviare programmi trascrizionali distinti. Esiste, tuttavia, un gran numero di geni comuni che possono essere regolati da tutte e tre le proteine, come recentemente esaminato in Harms et al. (2004).Pertanto, quando p53 attiva la trascrizione di p73 delta N, la proteina p73 delta N può legarsi a molti dei geni regolati da p53, ma l’assenza di un dominio di transattivazione la fa agire come un repressore o un concorrente dell’attivazione trascrizionale di p53. In questo modo, viene creato un ciclo di feedback negativo e l’attività di p53 diminuisce (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (Figura 9). Pertanto, cinque di questi circuiti di feedback positivi o negativi (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) coinvolgono geni e proteine che sono membri centrali di altre vie di trasduzione del segnale, mentre due (ciclina G e p73 delta N) formano cicli di feedback negativi diretti.

Gli ultimi cicli di feedback negativi da discutere si presentano sotto forma di ubiquitina ligasi. Sorprendentemente, sembrano esserci tre diverse attività di p53-ubiqutina ligasi (MDM-2, Cop-1 e Pirh-1), ciascuna delle quali forma un ciclo autoregolatorio con conseguente attività di p53 inferiore (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (Figura 10). Ogni gene è attivato trascrizionalmente da p53. Al momento non è chiaro il motivo per cui esiste questo livello di ridondanza. Diverse possibilità sono che questi prodotti genici siano espressi o agiscano in modo ottimale in diversi tipi di cellule o tessuti o anche in diversi stadi di sviluppo. Ad esempio, il topo knockout MDM-2 è letale a circa 6 giorni dopo la fecondazione, proprio al momento dell’impianto della blastocisti. Ciò può essere innescato dall’ipossia che deve verificarsi in quella fase, attivando p53 in assenza di MDM-2 e causando apoptosi. Coerente con questa interpretazione è l’osservazione che un topo double knockout p53, MDM-2 è vitale e nasce normalmente come un topo knockout p53 (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Ciò è quindi coerente con l’idea che la proteina MDM-2 agisca senza un’attività di backup dell’ubiquitina ligasi nella fase di blastocisti, ma queste altre proteine potrebbero consentire una funzione più normale nelle fasi successive dello sviluppo. Queste idee sono ora testabili. È anche possibile che una o più di queste tre ubiquitine ligasi siano coinvolte nel mantenimento dei livelli di p53 nello stato non stressato o basale, mentre altre agiscono solo dopo la produzione di una p53 indotta da stress. Le proteine p53 attivate e p53 indotte dallo stress hanno modificazioni proteiche molto diverse e l’impatto di questo sull’attività di MDM-2, Cop-1 o Pirh-2 è attualmente poco chiaro. Sembra probabile che ciascuna di queste tre ligasi dell’ubiquitina formi complessi proteici nella cellula e le proteine associate potrebbero differire per ciascuna di queste ligasi, collegandole a diversi circuiti regolatori. Al momento, si sa molto sull’MDM-2 e relativamente poca attenzione è stata posta sul ruolo di Cop-1 e Pirh-2, che sono stati riportati in letteratura solo nell’ultimo anno circa. Inoltre, molto recentemente è stato dimostrato che p53 è il substrato di un altro enzima E3 ubiquitina ligasi, topors (Rajendra et al., 2004). Resta da determinare se topors è anche un bersaglio trascrizionale di p53 e quindi dovrebbe essere aggiunto all’elenco crescente di proteine che contribuiscono al controllo autoregolatorio della via p53. I prossimi anni di studio dovrebbero affrontare queste domande.

Come accennato in precedenza, molti dei circuiti normativi coinvolgono MDM-2, evidenziando così il ruolo centrale dell’MDM-2 nel controllo dell’attività di p53. Un’analisi genetica delle mutazioni p53 e MDM-2 che bloccano questo complesso proteico ha identificato residui amminoacidici critici in ciascuna proteina che sono importanti per questa interazione di legame (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). È stato dimostrato che questi stessi residui amminoacidici entrano in contatto con queste proteine nella struttura cristallina dell’ammino-terminale di HDM-2 (la proteina umana) e di un peptide dall’ammino-terminale di p53 (Kussie et al., 1996) . I residui di fenialanina 19, triptofano 23 e leucina 26 di p53 formano i principali contatti nella tasca idrofobica dell’MDM-2. La fosforilazione dei residui di serina 20 e possibilmente di serina 15 dovrebbe indebolire questi contatti, e peptidi e farmaci che competono con questi contatti bloccano il complesso p53 MDM-2 e promuovono l’apoptosi nelle cellule (Klein e Vassilev, 2004). Pertanto, il complesso p53-MDM-2 e l’attività dell’ubiquitina ligasi MDM-2 sono diventati uno dei principali bersagli farmacologici per alcuni tumori. In circa un terzo dei sarcomi umani e in alcune leucemie e glioblastomi, il gene HDM-2 è stato amplificato e questa proteina è sovraespressa. Il gene p53 è di tipo selvatico e la proteina p53 è apparentemente inattiva, quindi i farmaci che rompono il complesso p53-HDM-2 dovrebbero attivare p53. Inoltre, molti altri tumori sembrano esprimere il prodotto del gene HDM-2 a livelli elevati anche quando il gene HDM-2 non è amplificato. In questi tipi di cancro, il blocco dell’attività di HDM-2 o la liberazione di p53 da questo complesso potrebbe indurre l’apoptosi selettivamente nelle cellule tumorali. Ciò potrebbe anche migliorare l’attività chemioterapica di alcuni farmaci che attivano p53.

Si prevede che il ciclo autoregolatorio p53-MDM-2 crei un oscillatore con livelli di p53 e MDM-2 che aumentano e diminuiscono con il tempo e fuori fase nella cellula. Ciò è stato dimostrato innanzitutto misurando i livelli di MDM-2 e p53 utilizzando Western blot di proteine da cellule in coltura sottoposte a una risposta allo stress di p53 (Lev Bar-Or et al., 2000). Sebbene le oscillazioni vengano osservate e attenuate nel tempo, questo esperimento calcola la media delle concentrazioni di proteine di molte cellule in coltura che possono essere sfasate nelle loro oscillazioni, dando origine a interferenze costruttive o distruttive. Per questo motivo, le proteine di fusione p53 e HDM2 marcate in modo fluorescente sono state sottoposte a imaging nelle singole cellule per seguire i cambiamenti nei livelli di p53 e HDM-2 nelle cellule sottoposte a una risposta allo stress di p53. Sono state osservate le oscillazioni attese sfasate e sorprendentemente il numero di oscillazioni in una cellula era proporzionale alla dose di radiazione data a queste cellule (Lahav et al., 2004). Ciò suggerisce che p53 può misurare l’intensità di un segnale di stress in modo digitale (numero di oscillazioni) e non in modo analogico (concentrazioni di p53 più elevate). Oscillazioni simili sono state osservate in altre vie di trasduzione del segnale che hanno circuiti autoregolatori negativi come la via NF-κ-B con le proteine NF-κ-B e I-κ-B (Scott et al., 1993). Questi segnali digitali risultanti dalle oscillazioni nella quantità di fattori di trascrizione potrebbero benissimo provocare un modello di espressione genica periodica. Tuttavia, il modo in cui i segnali digitali a livello del fattore di trascrizione vengono tradotti in segnali analogici a livello della quantità di mRNA prodotta da un gene rimane poco chiaro. Questi esperimenti portano alla possibilità che diversi numeri di oscillazioni, la temporizzazione o la lunghezza d’onda delle oscillazioni o l’ampiezza di queste oscillazioni possano influire sul modello selezionato di espressione genica e sull’esito (arresto del ciclo cellulare, apoptosi o senescenza) della p53 risposta.

Perché ci sono così tanti cicli di feedback nel percorso p53? Ci sono molte risposte a questa domanda. Tutti i meccanismi potrebbero non essere attivi nella stessa cellula o tipo di tessuto o nelle stesse fasi durante lo sviluppo. I circuiti di retroazione del tipo qui descritto forniscono un mezzo per collegare il percorso p53 con altri percorsi di trasduzione del segnale e coordinare i segnali cellulari per la crescita e la divisione. Le ridondanze in un sistema a volte possono prevenire gli errori e un sistema di backup riduce il fenotipo delle mutazioni. D’altra parte, non tutti i circuiti di feedback mostrati nelle Figure 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 possono resistere alla prova del tempo e ad ulteriori sperimentazioni. Molti di questi percorsi sono stati chiariti da esperimenti condotti con cellule tumorali in coltura che presentano mutazioni che alterano questi percorsi. Anche le cellule normali in coltura o topi knockout (a causa della sistemazione alla mutazione) potrebbero non riflettere tutte le condizioni che si verificano nelle cellule e negli organi normali in vivo. È particolarmente difficile dimostrare che una specifica proteina chinasi o fosfatasi agisce su un substrato specifico in vivo e ha un risultato che può essere misurato quantitativamente. Pertanto, dobbiamo continuare a testare e mettere alla prova le funzioni e i percorsi che crediamo operino in una cellula. Tuttavia, questi costrutti, mostrati nelle Figure 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, sono utili per formulare ipotesi e testare idee che porteranno sicuramente a nuove intuizioni sulla natura dei tumori e sulla progettazione di farmaci e agenti che uccidono selettivamente le cellule tumorali.