4 Pili
I pili sono strutture filamentose ed extracellulari che consentono ai batteri di aderire alle superfici biotiche e abiotiche. Una varietà di pili è stata identificata sulla superficie cellulare di Aeromonas spp. con i primi studi che descrivevano inizialmente due distinti tipi di pili a causa delle loro differenze strutturali: pili corto-rigido (S / R) e lungo ondulato (L / W) (Carrello, Silburn, Budden, & Chang, 1988; Ho, Mietzner, Smith, & Schoolnik, 1990). È stato riportato che i ceppi di Aeromonas raccolti da campioni ambientali mostrano preferenzialmente un gran numero di pili S / R, mentre gli isolati da campioni clinici avevano maggiori probabilità di produrre un piccolo numero di pili L / W (Carrello et al., 1988); proponendo L / W pili da coinvolgere nella virulenza. Nei batteri Gram negativi, ci sono quattro gruppi principali di pili batterici: pili assemblati dalla “via chaperone-usciere”, pili di tipo IV, pili assemblati dalla via di nucleazione extracellulare e pili assemblati dalla “via alternativa chaperone-usciere”. Aeromonas spp. sono stati trovati per esprimere pili di tipo I assemblati dal “percorso chaperone-usher” e pili di tipo IV. Studi ultra-strutturali condotti da Ho et al. (1990) sul pilus S / R di A. hydrophila AH26 rivelò che il pilin (unità ripetitiva principale del pilus) aveva omologia con il pili di tipo I e Pap (pili associato alla pielonefrite) da E. coli (Ho et al., 1990), e appartengono al gruppo dei pili riuniti dal sentiero accompagnatore-usciere. I pili di tipo I delle specie mesofile di Aeromonas sono stati associati all’autoagglutinazione delle cellule ma non alla patogenicità. Studi sull’aderenza di Honma e Nakasone (1990) hanno dimostrato che sebbene il loro ceppo di A. hydrophila (Ae6) fosse altamente aderente all’intestino di coniglio e umano, gli anticorpi sollevati al pili S / R non bloccavano l’aderenza alle cellule e si staccavano inoltre non aveva affinità con le cellule ospiti. I geni che codificano il tipo I pili sono stati ora localizzati nei genomi di un certo numero di specie di Aeromonas tra cui alcune specie mesofile e l’aeromonad psicrofilo, A. salmonicida subsp salmonicida (Reith et al., 2008; Seshadri et al., 2006). A differenza degli aeromonadi mesofili, il pilus di tipo I di A. salmonicida sembra avere un ruolo nella colonizzazione del salmone atlantico. Studi mutazionali condotti da Dacanay e collaboratori (2010) hanno dimostrato che A. salmonicida priva del pilus operon di tipo I ha una ridotta capacità di aderire al tratto gastrointestinale del salmone atlantico. Tuttavia, una volta aderito, la capacità mutante di invadere l’ospite era paragonabile al tipo selvatico, suggerendo che i pili di tipo I fossero coinvolti solo nelle fasi iniziali della colonizzazione (Dacanay et al., 2010).
Quantità considerevoli del lavoro svolto sull’adesione aeromonad si è concentrato sui pili L / W. Studi di aderenza con una varietà di ceppi mesofili negli anni ’90 hanno evidenziato l’importanza di queste appendici nella colonizzazione dei tessuti ospiti. È stato dimostrato che la rimozione meccanica del pili L / W dalla superficie cellulare batterica o il pretrattamento delle cellule batteriche con un anticorpo anti-pilin blocca l’adesione batterica a una varietà di linee cellulari umane e animali (Barnett & Kirov, 1999; Hokama, Honma, & Nakasone, 1990; Honma & Nakasone, 1990; Iwanaga & Hokama, 1992; Kirov, Hayward, & Nerrie, 1995; Nakasone, Iwanaga, Yamashiro, Nakashima, & Albert, 1996). I pilini L / W hanno generalmente un peso molecolare compreso tra 19 e 23 kDa e sono antigenicamente diversi, con solo la sequenza amminoacidica N-terminale che mostra omologia con i pilini di tipo IV (Kirov & Sanderson, 1996). Alcuni pili di tipo IV sono in grado di formare reti o fasci filamentosi (Kirov, Hayward, et al., 1995) e sono questi pili formanti fasci (Bfp), in particolare, che sono considerati i principali fattori di colonizzazione nelle Aeromonas spp. Il primo Bfp isolato da una specie di Aeromonas era di A. veronii biovar sobria (ceppo BC88) (Kirov & Sanderson, 1996). La sequenza N-terminale del pilin maggiore da questo Bfp mostrava l’omologia di sequenza con l’emagglutinina sensibile al mannosio (MSHA) tipo IV pilin da Vibrio cholerae (Kirov & Sanderson, 1996) che appartiene alla famiglia di pilins di tipo IVa “classica” rispetto alla famiglia di tipo IVb a cui appartengono abitualmente i Bfp. La A. veronii bv. Il pilus che forma un fascio di sobria è stato successivamente dimostrato con mezzi genetici come un membro della famiglia dei pilus MSHA (Hadi et al., 2012). L’espressione dell’MSHA pilus in questi studi sembrava essere regolata dal punto di vista ambientale poiché A. veronii biovar sobria ha mostrato una maggiore espressione quando è cresciuta a 22 ° C in coltura liquida, rispetto a 37 ° C su terreno solido (Kirov & Sanderson, 1996). Questi risultati concordavano anche con studi precedenti di Kirov, Hayward, et al.(1995) dove A. veronii bv. Gli isolati di sobria hanno mostrato un’espressione ottimale delle strutture filamentose a 22 ° C, con alcuni ceppi ambientali che hanno mostrato un’espressione ottimale a 7 ° C. Ulteriori indagini sui pili di tipo IV presenti su A. veronii bv. sobria ha portato alla scoperta di un nuovo sistema di pilus di tipo IV, il Tap pilus, che è risultato differire in modo significativo dal Bfp (Kirov & Sanderson, 1996). Poco dopo la sua rilevazione iniziale in A. veronii bv. sobria, i geni della biogenesi Tap pili sono stati identificati in A. hydrophila (Ah65) (tapABCD) e si è scoperto che condividono l’omologia con i geni pilus di tipo IV in P. aeruginosa (pilABCD); i geni di A. hydrophila erano in grado di completare le corrispondenti mutazioni in P. aeruginosa (Pepe, Eklund, & Strom, 1996). Sebbene Tap pili sia presente in tutti i ceppi di Aeromonas i cui genomi sono stati finora sequenziati, si sa molto poco sulla loro funzione. La delezione del gene Tap pilin (tapA), e quindi la delezione del filamento Tap pilus, non ha avuto alcun effetto sulla capacità clinica di A. veronii bv. la sobria si isola per aderire alle cellule HEp-2, aderire alle cellule intestinali umane o colonizzare un modello di topo giovane; risultati simili sono stati riportati anche con un isolato di pesce di A. hydrophila (Kirov, Barnett, Pepe, Strom, & Albert, 2000). Il Tap pilus contribuisce alla patogenicità dello psicrofilo aeromonad A. salmonicida subsp. salmonicida, tuttavia, quando si infetta il salmone atlantico; sebbene non sia essenziale per la virulenza poiché i mutanti tapA conservano gran parte della loro capacità di colonizzare l’ospite (Boyd et al., 2008). L’analisi dell’espressione genica in A. salmonicida ha dimostrato che il Tap pilus è espresso costitutivamente e, insieme a tapABCD, il sistema Tap pilus è anche codificato su altri 18 geni sparsi nel genoma (Boyd et al., 2008), simili al tipo IV pili geni di Pseudomonas e Neisseria spp. (Mattick, 2002). Mentre il ruolo del Tap pilus resta da chiarire, la sua biogenesi ha forti implicazioni sulla virulenza in altri modi. TapD, una prepilina peptidasi (Pepe et al., 1996) non è richiesta solo per l’elaborazione delle prepiline (da più sistemi pilus) prima che siano incorporate nel filamento pilus ma anche per l’elaborazione delle pseudopiline del T2SS, che sono essenziali per la secrezione di molti fattori di virulenza, come proteasi, emolisina e DNasi (Hadi et al., 2012; Kirov et al., 2000).
Insieme a MSHA e Tap pilus, un terzo il tipo IV pilus, appartenente alla classe di tipo IVb, è stato identificato anche nella A. salmonicida subsp. salmonicida, chiamato Flp pilus per la sua omologia con il sistema Flp di Actinobacillus actinomycetemcomitans (Boyd et al., 2008). In A. salmonicida, i geni di questo pilus si trovano in un singolo operone (flpA-L) e la sua espressione è regolata dal ferro, con sovraregolazione dei geni che si verifica in condizioni di basso contenuto di ferro (Boyd et al., 2008). Si sa molto poco sul ruolo del Flp pilus in Aeromonas e nonostante sia un sistema regolamentato non sembra essere coinvolto nella virulenza di A. salmonicida poiché i ceppi con deficit di flp hanno mantenuto pienamente la loro capacità di colonizzare e infettare il salmone atlantico (Boyd et al ., 2008). È stato riscontrato che il Flp pilus è diffuso tra i batteri e contribuisce alla formazione di biofilm e all’autoagglutinazione (Kachlany et al., 2000; Planet, Kachlany, Fine, DeSalle, & Figurski, 2003) ; pertanto può essere più importante nelle interazioni batteri-batteri piuttosto che nelle interazioni cellula ospite.
Pertanto, tre distinti sistemi di pili di tipo IV sono stati descritti negli aeromonad, con la maggior parte delle specie che ne possiedono almeno due. Per gli aeromonadi mesofili, i primi studi sull’aderenza negli anni ’90 hanno suggerito che il pilus formante il fascio MSHA è la principale appendice filamentosa responsabile dell’aderenza e della colonizzazione dei tessuti, tuttavia solo di recente questo è stato geneticamente determinato da Hadi et al. (2012). Un locus MSHA di 22 kb Bfp è stato isolato e caratterizzato da A. veronii bv. sobria che si è scoperto essere costituito da 17 geni disposti in due operoni, quattro dei quali codificano prepiline (una maggiore e tre minori) per le subunità del filamento pilus (Hadi et al., 2012). Si è concluso che tutte e quattro le prepiline sono essenziali per la biogenesi del pilus con mutazioni individuali in ciascun gene prepilin riducendo l’aderenza batterica alle cellule HEp-2 del 90% (Hadi et al., 2012). È stata inoltre valutata la capacità dei mutanti di formare biofilm e dimostrato che i geni MSHA pilus di A. veronii bv. i sobria sono essenziali per la formazione del biofilm. Questi studi hanno confermato che l’MSHA pilus è il principale sistema di aderenza in A. veronii bv. sobria e questo potrebbe essere il caso anche per altre specie mesofile di Aeromonas. Sebbene l’operone pilus MSHA sia presente in A. salmonicida, vi è una delezione di otto geni all’interno dell’operone, incluso il gene che codifica per il pilina maggiore (Boyd et al., 2008). Il pilus MSHA in A.pertanto non si prevede che salmonicida venga espressa e quindi sembra che aiuti solo la virulenza degli aeromonadi mesofili.