Un’analisi comparativa fenotipica e genomica di ceppi di topi C57BL / 6J e C57BL / 6N

Confronti di sequenze genomiche di topi C57BL / 6N e C57BL / 6J per SNP e piccoli indel

Abbiamo utilizzato l’allineamento paired-end di C57BL / 6N al genoma di riferimento (C57BL / 6J) dal progetto 17 Mouse Genomes. Tuttavia, l’elenco delle varianti di differenziazione (SNP, piccoli indel e SV) tra i due genomi è stato recentemente creato utilizzando nuove procedure integrate al fine di aumentare la probabilità di identificare accurate modifiche di sequenza putativa. Un passaggio chiave dell’analisi per identificare un insieme di varianti di alta qualità dall’allineamento è stato quello di utilizzare la sequenza genomica di lettura breve appena generata di C57BL / 6J generata dal Broad Institute. Questo ci ha permesso di identificare gli errori di assemblaggio nella sequenza di riferimento. Inoltre, abbiamo aggiornato il metodo di rilevamento delle varianti: in primo luogo, utilizzando software diverso e / o più evoluto per rilevare le varianti; in secondo luogo, eseguendo la cura manuale su tutte le varianti di codifica e in terzo luogo, mediante un’ampia convalida di un’ampia percentuale delle varianti (comprese tutte le varianti di codifica) per confermare le previsioni di sequenza. Questi passaggi hanno fornito un robusto set di dati di varianti di codifica di alta qualità, riducendo considerevolmente il tasso di falsi positivi.

Per identificare SNP e piccoli indel che differenziano i ceppi C57BL / 6J e C57BL / 6N, abbiamo utilizzato la coppia- letture finali generate dal progetto 17 Mouse Genomes. Abbiamo chiamato varianti utilizzando il Genome Analysis Toolkit (GATK) e abbiamo trovato 681.220 varianti che distinguono i ceppi C57BL / 6J e C57BL / 6N. Utilizzando la sequenza del genoma di lettura breve di C57BL / 6J generata dal Broad Institute, siamo stati in grado di filtrare potenziali errori di sequenziamento rimuovendo varianti comuni alla sequenza Broad C57BL / 6J, contrastando così le discrepanze nel riferimento e migliorando il falso negativo Vota. Le letture rimanenti sono state filtrate con un rapporto allelico inferiore a 0,8 (eterozigote) e coperte da meno di 3 o superiore a 150 letture. Questi passaggi hanno ridotto significativamente l’elenco, risultando in 10.794 varianti putative che sono state sottoposte a ulteriori analisi.

Utilizzando Sequenom, PyroSequencing e il sequenziamento di Sanger, abbiamo convalidato tutte le varianti di codifica e un sottoinsieme delle varianti non codificanti, che comprendeva 762 SNP e 169 piccoli indel. Le analisi sono state eseguite utilizzando un pannello di quattro campioni C57BL / 6J e quattro C57BL / 6N per confermare i genotipi (vedere Materiali e metodi). Abbiamo considerato una variante da convalidare quando tutti e quattro i campioni C57BL / 6J e C57BL / 6N mostravano genotipi coerenti all’interno di un sub-ceppo e varianti tra i sub-ceppi. Durante il processo di convalida, abbiamo eliminato 363 varianti per una serie di motivi, tra cui genotipi eterozigoti e incoerenti e errori della PCR. Per i restanti 568, 236 sono stati confermati come variante tra i sub-ceppi (vedere File aggiuntivo 1, Tabella S1).

Utilizzando i programmi di annotazione NGS-SNP e Annovar, la posizione genomica e altre caratteristiche del gene sono state esaminato. Le varianti di sequenza convalidate finali tra C57BL / 6J e C57BL / 6N consistevano in 34 SNP codificanti, 2 piccoli indel codificanti, 146 SNP non codificanti e 54 piccoli indel non codificanti. Le varianti di codifica includevano 32 SNP missenso, 1 mutazione senza senso, 1 mutazione di splicing e 2 mutazioni frameshift (Tabella 1). Abbiamo scoperto che tutte le varianti tranne una (Zp2, cromosoma 7) erano private di C57BL / 6J o C57BL / 6N e non sono state trovate in nessuno degli altri 16 ceppi consanguinei sequenziati di recente.

Confronti di sequenze genomiche di topi C57BL / 6N e C57BL / 6J per varianti strutturali

Ancora una volta, utilizzando le letture paired-end generate dal 17 Mouse Genomes Project e una combinazione di quattro metodi, abbiamo identificato 551 SV tra C57BL / 6J e C57BL / 6N. Come descritto altrove, abbiamo ispezionato visivamente la mappatura paired-end di lettura breve in questi 551 siti SV nei 17 ceppi inbred sequenziati di topi e nel genoma sequenziato Broad J. In questo modo, siamo stati in grado di conservare 81 dei 551 siti per ulteriori analisi sperimentali (470 siti previsti sono risultati falsi a causa di errori di mappatura paired-end). Le analisi di sequenziamento basate su PCR e Sanger in questi 81 siti mantenuti ci hanno permesso di rimuovere altri 38 siti, che sono stati confermati come non polimorfici tra C57BL / 6J e C57BL / 6N a causa di errori di riferimento. Infine, tutte le 43 varianti previste sono state convalidate come SV autentiche che differenziano i ceppi C57BL / 6J e C57BL / 6N (Tabella 2), risultando in un tasso di falsi positivi nullo.

Delle 43 SV, 15 si sovrappongono a un gene (Tabella 2), comprese 12 varianti che si trovano all’interno di regioni non codificanti dei geni, 2 varianti che influenzano la regione codificante del gene (Vmn2r65 (Vomeronasal 2, recettore 65) e Nnt (nicotinamide nucleotide transidrogenasi)) e 1 che colpisce l’intero gene Cyp2a22 (citocromo P450, famiglia 2, sottofamiglia a, polipeptide 22). Solo 1 delle 15 varianti è nota ed è già stata associata a un fenotipo, Nnt; i restanti 14 sono nuovi e per molti discuteremo le loro potenziali funzioni biologiche di seguito.

Usando il ratto come specie esterna, abbiamo successivamente dedotto l’origine dei 43 SV tra C57BL / 6J e C57BL / 6N, e ha scoperto che 27 varianti erano il prodotto della retrotrasposizione, 15 erano SV mediate da non ripetizione e 1 era una ripetizione in tandem a numero variabile (VNTR) (Tabella 2). Sorprendentemente, quasi tutte le varianti erano private di C57BL / 6J o C57BL / 6N (Tabella 2).

Valutazione fenotipica completa dei topi C57BL / 6N e C57BL / 6J

In parallelo a alle analisi genomiche, il consorzio European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) ha effettuato un confronto fenotipico completo dei ceppi C57BL / 6NTac e C57BL / 6J. EUMODIC comprende quattro centri per topi che eseguono una fenotipizzazione primaria su vasta scala di 500 linee knockout mutanti di topo generate dai progetti European Conditional Mouse Mutagenesis (EUCOMM) e Knockout Mouse (KOMP) all’interno del programma IKMC. Coorti di topi di ciascuna linea mutante entrano nella valutazione del fenotipo European Mouse Phenotyping Resource of Normalised Screens (EMPReSSslim), che consiste di due pipeline di fenotipizzazione, che insieme comprendono 20 piattaforme di fenotipizzazione (identificate da un ESLIM__procedure_number) che vengono eseguite da 9 a 15 settimane (vedi File aggiuntivo 2, Figura S1). I metodi per eseguire ciascuna schermata sono descritti in dettaglio nelle procedure operative standard (SOP) che possono essere trovate nel database EMPReSS. I dati sono stati acquisiti su 413 parametri fenotipici insieme a 146 parametri di metadati e inseriti nel database EuroPhenome. Come parte di questo lavoro, abbiamo acquisito ampi dati di controllo sul fenotipo di base di C57BL / 6NTac. Abbiamo anche colto questa opportunità per studiare il fenotipo dei topi C57BL / 6J e per confrontarlo con C57BL / 6NTac (d’ora in poi denominati rispettivamente J e N).

Per ogni linea, N e J, età topi corrispondenti sono stati analizzati attraverso entrambe le pipeline EMPReSSslim. I dati sono stati acquisiti da tutti e quattro i centri del consorzio per 19 delle 20 piattaforme dalla pipeline, escluse le analisi FACS (cell sorting attivato da fluorescenza) (vedere File aggiuntivo 2, Figura S1). I protocolli EMPReSSslim sono stati rigorosamente standardizzati nel consorzio EUMODIC; tuttavia, rimangono alcune differenze, ad esempio, nell’attrezzatura e nella dieta, e questo viene catturato nei set di metadati all’interno di EuroPhenome. Ovviamente ci saranno altre differenze ambientali non riconosciute tra i centri. Collettivamente, questi possono contribuire alle differenze gene-ambiente e all’esito fenotipico, ma non abbiamo cercato di definire sistematicamente questi effetti, concentrandoci invece su fenotipi che sono concordanti tra i centri e sono chiaramente robusti a perturbazioni ambientali non riconosciute. I dati delle coorti N e J di ciascun centro sono stati depositati in EuroPhenome e sono stati sottoposti ad un’analisi statistica per ciascun centro (vedi Materiali e metodi). È importante notare qui che i confronti tra N e J sono stati eseguiti all’interno, non tra i centri. L’analisi statistica dei risultati tra i centri non è stata eseguita, poiché non è stato possibile controllare completamente gli esperimenti tra i centri a causa delle variabili ambientali e di altre variabili e delle differenze nel numero di animali analizzati in ciascun centro (vedere File aggiuntivo 3, Figura S2a-d). Abbiamo quindi scelto di adottare un approccio incentrato sul confronto dei ceppi all’interno dei singoli centri invece di generare un modello statistico multicentrico che ha esaminato una differenza statistica complessiva tra i due ceppi. Tuttavia, la replicazione del confronto N e J tra più centri ci ha fornito un potere aggiuntivo nel confermare differenze fenotipiche significative tra i due ceppi. Oltre all’analisi di N e J attraverso la pipeline di fenotipizzazione primaria EMPReSSslim presso i quattro centri, altri partner del consorzio EUMODIC hanno applicato una gamma più ampia di test di fenotipizzazione spesso più sofisticati per raccogliere ulteriori informazioni, alcune delle quali esplorano ulteriormente e mirano a convalidare le differenze fenotipiche rivelate tramite EMPReSSslim.

Nell’analizzare i dati, ci siamo concentrati prima sull’identificazione dei parametri fenotipici che mostravano una differenza consistente e significativa tra N e J in tre o più centri.Abbiamo identificato 27 parametri fenotipici in questa classe (Figura 1a; vedere File aggiuntivo 3, Figura S2a, e). In molti casi, queste differenze sono state supportate dai dati dell’analisi secondaria e discuteremo di questi casi di seguito. Abbiamo anche scoperto una seconda classe di parametri per i quali sono state osservate tendenze simili in due centri, ma nessuna evidenza di tendenze è stata osservata negli altri due centri (Figura 1b; vedere File aggiuntivo 3, Figura S2b, f). Tuttavia, la nostra analisi statistica (vedi Materiali e metodi) indica che per questa classe di parametri la significatività complessiva delle differenze N rispetto a J è bassa e le tendenze osservate devono essere trattate con cautela. In molti di questi casi, tuttavia, le tendenze osservate sono coerenti con i fenotipi trovati nella prima classe di parametri. Abbiamo anche identificato una terza ma piccola classe di parametri che mostrava differenze molto significative in due o più centri (Figura 2; vedere File aggiuntivo 3, Figura S2d, h), ma inaspettatamente, la tendenza opposta in uno dei centri. Discutiamo le ragioni di queste anomalie, che in alcuni casi presumibilmente derivano da interazioni gene-centro. La classe finale rappresenta un gran numero di test in cui non abbiamo osservato differenze consistenti e significative tra i centri, concludendo che è più probabile che si tratti di falsi positivi piuttosto che prove di differenze N / J (vedere File aggiuntivo 3, Figura S2c , g).

Dismorfologia e oftalmologia

Non abbiamo trovato prove di differenze importanti nelle caratteristiche morfologiche tra N e J, inclusa l’analisi a raggi X dello scheletro. Tuttavia, sono state identificate una serie di differenze oftalmologiche tra i due ceppi. L’analisi delle funzioni visive generali utilizzando il tamburo optocinetico virtuale ha rilevato una visione ridotta in N rispetto ai topi J (N: 0,314 cicli / grado, IC 95% da 0,305 a 0,323, n = 89; J: 0,399 cicli / grado, IC 95% 0,394 to 0.404, n = 128; p < 0.001, Student “s t-test). Ciò non rifletteva differenze nelle opacità delle lenti, poiché l’analisi quantitativa utilizzando una fotocamera Scheimpflug ha rilevato lenti trasparenti in entrambi i ceppi (N: 5,2 + 0,5%, n = 10; J: 5,0% + 0,5% di opacità, n = 10). Sono state osservate macchie bianche nel fondo di topi N ad alta frequenza, che erano assenti nei topi J ( Figura 3A). Ciò è probabilmente dovuto alla presenza della mutazione Crb1rd8 nei topi N, come riportato in precedenza, anche se nel nostro caso le macchie sono state osservate solo nella retina ventrale, con variazioni nella dimensione delle macchie e nell’area interessata tra i topi (Figura 3A) Ulteriori studi utilizzando l’endoscopia topica del fondo hanno mostrato che il numero dei vasi principali era variabile, compreso tra tre e sette per le vene e tre e eig ht per le arterie (Figura 3B) e un dato topo potrebbe avere numeri non corrispondenti tra i due occhi. Il numero medio di vene e arterie era significativamente più alto (P < 0,001) nei topi J rispetto ai topi N (Figura 3C).

Cardiovascolare

Le misurazioni non invasive della pressione sanguigna (ESLIM_002) hanno mostrato che la pressione arteriosa sistolica era significativamente più alta nei topi J rispetto ai topi N, sebbene la significatività dell’effetto fosse variabile tra i sessi e tra i centri. Inoltre, tutti i centri hanno osservato che la frequenza del polso era significativamente più alta nei topi N rispetto ai topi J.Tuttavia, un partner secondario all’interno del consorzio ha scoperto che la frequenza cardiaca sotto anestesia era significativamente più bassa nei topi maschi N rispetto ai topi maschi J, che si riflette in un lungo intervallo inter-battito (RR) e QTc. Abbiamo anche scoperto che il peso del cuore normalizzato alla lunghezza della tibia (ESLIM_020) era significativamente più basso nei topi N rispetto ai topi J in due dei centri, e questi risultati sono stati confermati indipendentemente dall’analisi secondaria. Ulteriori studi sulla struttura e funzione cardiaca mediante ecocardiografia e sulla funzione contrattile cardiaca mediante emodinamica non sono riusciti a rivelare alcuna differenza tra N e J (dati non mostrati).

Metabolismo

Per misurazioni calorimetriche indirette di topi alimentati liberamente (ESLIM_003), abbiamo trovato una differenza consistente tra N e J per il consumo di O2, la produzione di CO2 e la produzione di calore. I topi J hanno mostrato un ridotto scambio di gas e un minor dispendio energetico (produzione di calore o tasso metabolico) rispetto a N, che era generalmente più marcato nelle femmine. Nella fenotipizzazione secondaria con calorimetria indiretta a digiuno, c’era una tendenza verso un minore dispendio energetico in J rispetto a N durante il periodo notturno. Ciò era probabilmente associato a una diminuzione dell’attività deambulatoria in J e a una minore assunzione di cibo in J rispetto a N durante il periodo notturno, specialmente durante la rialimentazione (dati non mostrati). Non c’era una differenza consistente nell’attività nello schermo calorimetrico ad alimentazione libera (ESLIM_003) nei due centri in cui è stata misurata l’attività (vedere File aggiuntivo 3, Figura S2c, g). I test di tolleranza al glucosio intraperitoneale semplificati (IPGTT) (ESLIM_004) hanno mostrato una ridotta tolleranza al glucosio nei topi J rispetto a N. Queste osservazioni sul metabolismo del glucosio sono coerenti con la nota delezione del gene Nnt specifico dei topi J, che ha dimostrato di svolgere un ruolo nella regolazione della risposta insulinica nelle cellule beta pancreatiche.

Doppia energia X -ray assorbimetria (DEXA) composizione corporea e misurazioni della densitometria ossea (ESLIM_005) hanno mostrato che i topi N hanno aumentato la massa grassa (sia assoluta che normalizzata al peso). Inoltre, le misurazioni DEXA hanno indicato che i topi J hanno una massa magra aumentata rispetto a N. In due dei centri, le misurazioni della densità minerale ossea erano più alte nei topi maschi J; tuttavia, questo risultato non è stato replicato nel terzo centro che ha effettuato gli schermi DEXA. Abbiamo proceduto ad intraprendere un’analisi di tomografia micro-computerizzata (μCT) dei due ceppi (Figura 4) e abbiamo scoperto che lo spessore corticale, la porosità corticale e il volume osseo trabecolare erano invariati tra N e J. Inoltre, l’analisi di varie microarchitettura i parametri indicavano che la rete trabecolare complessiva era simile. Infine, la misurazione della formazione ossea e dei marker di riassorbimento non è riuscita a rivelare alcuna differenza tra i due ceppi (Figura 4).

Neurologico, comportamentale e sensoriale

Due centri hanno mostrato differenze importanti e consistenti tra N e J nell’attività in campo aperto (ESLIM_007) (Figura 2), inclusa una maggiore attività nei topi J misurata dalla distanza percorsa e un numero maggiore di voci centrali, indicativo di ansia ridotta. Queste differenze sono in accordo con i dati riportati di recente su un confronto comportamentale di N e J. È interessante notare che gli effetti più significativi sono stati limitati ai maschi nei due centri. Inaspettatamente, in un terzo centro, si è visto il contrario, con N topi più attivi di J, sebbene questi effetti siano stati osservati sia nei maschi che nelle femmine. Un quarto centro non ha rilevato questi effetti, non trovando differenze significative. Tutti i centri hanno utilizzato EMPReSSslim SOP per la procedura, che includeva un requisito per arene di dimensioni simili, ma c’erano alcune differenze operative tra i centri, incluso l’uso di stanze singole o multiple per ospitare le arene; arene dai lati trasparenti o opachi; e l’assenza o la presenza di arricchimento ambientale nelle gabbie domestiche (che è noto per avere un effetto sui risultati comportamentali). Tuttavia, nessuna di queste variabili era coerente con le diverse osservazioni tra i centri.Tuttavia, non possiamo escludere le influenze del microbioma intestinale, che potrebbero differire tra i centri. È noto che il microbioma intestinale influenza la funzione e il comportamento del sistema nervoso centrale, principalmente attraverso l’asse ipotalamo-ipofisi-surrene. Concludiamo che in determinate condizioni, possono essere viste differenze significative nei parametri in campo aperto tra N e J, ma la natura di queste differenze è sensibile a condizioni ambientali sconosciute. È interessante notare che la principale scoperta contraddittoria nei fenotipi N contro J era limitata a una piattaforma di fenotipizzazione comportamentale. Al contrario, per la maggior parte degli altri test (a parte alcuni parametri di chimica clinica e ematologica, vedi sotto), non abbiamo trovato incongruenze, indicando che, contrariamente alla maggior parte delle piattaforme di fenotipizzazione, le analisi comportamentali possono essere acutamente sensibili ai parametri ambientali.

Abbiamo anche effettuato un test di transizione luce / buio per confrontare l’ansia nei ceppi N e J (Figura 5). Non abbiamo trovato differenze significative tra i topi N e J nel numero di transizioni luce-buio o nella percentuale di tempo trascorso nel compartimento buio. Tuttavia, la latenza per entrare nel compartimento scuro era significativamente più alta nei topi N. I test SHIRPA modificati (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phenotype Assessment) (ESLIM_008, Figura 1a) in tutti e quattro i centri hanno indicato che i topi J maschi avevano un’attività locomotoria significativamente aumentata, correlata ai risultati di una maggiore distanza percorsa in test in campo aperto in alcuni centri (vedi sopra).

Abbiamo condotto una serie di test che riflettono la capacità motoria. Differenze nella forza di presa (ESLIM_009) sono state osservate in tutti i centri con J maggiore di N, ma i parametri interessati erano diversi, con alcuni centri che riportavano differenze nella forza di presa degli arti anteriori e alcuni per la forza di presa degli arti anteriori e posteriori combinati (Figura 1a , b). Il test Rotarod (ESLIM_010) ha mostrato differenze significative nella latenza a cadere in tutti i centri, sebbene la ridotta capacità motoria di N sia stata osservata solo per le donne in due dei centri. Abbiamo ulteriormente esplorato le capacità motorie nei topi maschi N e J esaminando le prestazioni di apprendimento motorio sul rotarod per 4 giorni (Figura 5). Mentre le prestazioni motorie dei topi J sono migliorate notevolmente dal giorno 1 al giorno 2, le prestazioni dei topi N sono migliorate solo gradualmente ed erano significativamente diverse dalle misurazioni del giorno 1 solo dal giorno 3 (P < 0,05) in poi. Inoltre, dal giorno 2 al giorno 4 ci sono state differenze molto significative nella latenza per cadere tra N e J. I test primari effettuati presso i centri hanno così scoperto una potenziale riduzione delle prestazioni motorie in N che è stata confermata ed ulteriormente elaborata da test più sofisticati delle prestazioni di apprendimento motorio.

Abbiamo anche effettuato due ulteriori test comportamentali per elaborare ulteriormente le differenze N rispetto a J. In primo luogo, abbiamo confrontato le prestazioni di N e J nel test Morris water maze utilizzato per valutare la memoria spaziale. I topi maschi N hanno mostrato prestazioni molto significativamente ridotte (latenza più elevata) rispetto ai topi maschi J (Figura 6). In secondo luogo, abbiamo esaminato l’apprendimento emotivo o la memoria per un evento avversivo utilizzando lo spunto e test contestuali di condizionamento della paura; tuttavia, qui non abbiamo trovato differenze significative tra i due ceppi (dati non mostrati).

L’esplorazione del sussulto acustico e dell’inibizione pre-impulso (ESLIM_011) (Figura 1a) nei due ceppi ha identificato una varietà di parametri che erano significativamente e costantemente differenti tra i centri. L’ampiezza dello shock acustico a 110 dB e l’ampiezza della risposta dello startle al pre-impulso e all’impulso (PP1-PP4 + impulso, vedere EMPReSSslim) sono state ridotte in N rispetto a J, sebbene questo effetto non sia stato osservato nelle femmine in un centro. Coerentemente con queste osservazioni, abbiamo scoperto che l’inibizione pre-impulso differiva tra N e J, con l’inibizione pre-impulso a PP2 e PP3 e l’inibizione globale aumentata in N rispetto a J. Diversi altri parametri di grandezza dello startle e inibizione pre-impulso hanno mostrato effetti significativi in uno o due centri (Figura 1b; vedere File aggiuntivo 3, Figura S2b, f) ma non sono state osservate differenze in altri centri. Le osservazioni sull’entità dello startle non sono state confuse dalle differenze nell’udito poiché abbiamo valutato le soglie uditive in entrambi i topi J e N utilizzando il test di risposta del tronco cerebrale uditivo e non abbiamo riscontrato differenze (dati non mostrati).

Chimica clinica

Sono stati eseguiti ampi pannelli di test di chimica clinica su campioni di plasma raccolti alla fine di ciascuna pipeline di fenotipizzazione. Il campione di sangue alla fine della pipeline 1 (ESLIM_021) è stato raccolto dopo un digiuno notturno, mentre il campione alla fine della pipeline 2 (ESLIM_015) proveniva da un animale alimentato liberamente.I dati concordanti da almeno tre centri hanno mostrato che l’urea e gli elettroliti sodio, potassio e cloruro erano significativamente più alti nel plasma dei topi J rispetto ai topi N (Figura 1a), sebbene vi fossero alcune chiare interazioni con il centro sessuale. I dati per i livelli di glucosio plasmatico alimentato liberamente ea digiuno hanno indicato che per ogni test, almeno due centri hanno riscontrato che i livelli di glucosio plasmatico erano più alti nei topi N rispetto ai topi J (Figura 1b). Tuttavia, è noto che i livelli di glucosio nel sangue sono influenzati dalla manipolazione degli animali, dall’elaborazione dei campioni e dall’uso di anestetici. I dati qui presentati provengono tutti da campioni raccolti sotto anestetico isofluorano gassoso, a parte un centro in cui i campioni sono stati raccolti sotto iniezione di ketamina / xilazina (vedere Figura 1). Come discusso in precedenza, a causa della loro nota compromissione nella secrezione di insulina, sembra contraddittorio che i topi J abbiano livelli di glucosio plasmatico inferiori rispetto ai topi N, ma la delezione in Nnt sembra influenzare solo i tassi di clearance del glucosio e i topi J a digiuno o non sfidati non soffre di iperglicemia costante. È stato dimostrato che molti altri parametri sono più alti nei topi J rispetto ai topi N in almeno due centri, ma in ogni caso gli altri centri non hanno riportato differenze significative negli stessi parametri (Figura 1b), ad esempio gli acidi grassi liberi. Due centri hanno scoperto che il ferro era significativamente più alto nei maschi N e che la fosfatasi alcalina era significativamente più alta nei maschi J. Uno di questi centri ha riscontrato che lo stesso vale anche per le donne (Figura 2). Tuttavia, i dati per ciascuno di questi parametri da un terzo centro contraddicono questi risultati.

Ematologia

Vari parametri ematologici sono stati misurati alla fine della pipeline 2 (ESLIM_016). Cambiamenti significativi in una serie di parametri sono stati trovati da due centri, ma questi risultati non sono stati replicati negli altri, inclusi i conteggi dei globuli bianchi e rossi, il volume medio delle cellule e l’emoglobina corpuscolare media (Figura 1b). Risultati contraddittori sono stati ottenuti per l’ematocrito e i test di concentrazione di emoglobina cellulare media (Figura 2). In ogni caso, i dati di due centri concordavano mentre un terzo centro mostrava l’effetto opposto. Ciò potrebbe essere potenzialmente dovuto alle diverse tecnologie delle macchine utilizzate per le misurazioni ematologiche nelle cliniche partecipanti, come registrato nei metadati.

Funzione immunitaria e allergia

Abbiamo studiato una serie di fenotipi secondari compresa la resistenza dell’ospite a Listeria monocytogenes nei ceppi J e N. Le femmine di entrambi i ceppi erano più suscettibili all’infezione da L. monocytogenes; tuttavia, la differenza di sesso nella suscettibilità dell’ospite di Listeria era meno pronunciata in N che in J. I maschi del ceppo N hanno mostrato una maggiore clearance di Listeria il giorno 4 dopo l’infezione rispetto ai maschi J. Ciò è correlato a una maggiore risposta pro-infiammatoria nei maschi N al terzo giorno dopo l’infezione rispetto ai maschi J (Figura 7).

Abbiamo anche testato topi N e J per ipersensibilità da contatto indotta dal dinitrofluorobenzene (DNFB) (CHS). Sono state identificate differenze significative nella risposta CHS tra i due ceppi di topi, con J che mostrava una risposta CHS aumentata. Notevolmente, i topi femmina di entrambi i ceppi hanno mostrato un aumento della CHS rispetto ai topi maschi. Lo studio della reattività delle cellule natural killer (NK) a vari stimoli ha mostrato che una frazione maggiore di cellule NK viene attivata dall’interleuchina (IL) -12 da sola o in combinazione con IL-2 in J rispetto ai topi N; ancora una volta, questa risposta è stata più significativa nelle femmine (Figura 8).