Definitie
DNA-polymerase is een belangrijke enzymgroep die betrokken is bij DNA-synthese, reparatie en replicatie; deze enzymen worden in alle levende organismen aangetroffen. Oorspronkelijk ontdekt tijdens onderzoek naar de Escherichia coli-bacterie, kennen we nu meerdere variëteiten met vergelijkbare structuren maar verschillende functies. Deze variëteiten zijn gegroepeerd in families naar functie en worden ook gebruikt op het gebied van genetische manipulatie.
Functie DNA-polymerase
DNA-polymerase heeft verschillende rollen in de mechanismen van DNA-synthese, reparatie en replicatie. DNA-polymerase is onderverdeeld in zeven verschillende families in eukaryoten, virussen, gisten en bacteriën. Deze zeven families zijn A, B, C, D, X, Y en reverse transcriptase (RT). Toekomstig onderzoek kan nog meer groepen ontdekken.
Elk van deze families bevat een subset van DNA-polymerasen die hun eigen reeks functies hebben. DNA-polymerase I is bijvoorbeeld een lid van de A-familie; DNA-polymerase IV of DinB is een lid van de X-familie. U hoeft niet elke naam te onthouden, maar de basisfunctie per groep helpt u ook om eiwitsynthese, genmutatie en genmodificatie beter te begrijpen.
De structuur van DNA-polymerase wordt vergeleken met een rechterhand met een handpalm, vingers en duim. Je kunt je een DNA-streng voorstellen die door een DNA-polymerasemolecuul beweegt zoals het lint door een typemachine. Heel eenvoudig gezegd helpen de vingers om de uitgepakte DNA-streng zorgvuldig te positioneren door de nucleotiden te herkennen, de palm is de actieve plaats waar fosforylering plaatsvindt (waarbij de fosfaatruggengraat wordt toegevoegd), en de duim bindt het DNA in een dubbele helixvorm bij het verlaten het DNA-polymerasemolecuul. Maar niet alle families van DNA-polymerase hebben dezelfde structurele componenten. Laten we de verschillende families wat gedetailleerder bekijken.
Polymerase Familie A
Familie A is een groep van DNA-replicatie- of DNA-herstel-enzymen. Bij DNA-replicatie matchen ze een nucleotidebase met de juiste partner. Dit is nodig wanneer een cel zich voorbereidt op de deling en het enkelstrengige chromosoom wordt gedupliceerd zodat beide cellen, moeder en dochter, een volledige set DNA hebben.
Als er een kopie van het DNA moet worden gemaakt, lopen DNA-polymerasemoleculen over de uitgepakte templaatstreng en kopiëren deze met tegenoverliggende nucleotiden. Dit levert een exacte kopie op van de coderende DNA-streng. Verschillende familie A-enzymen helpen bij DNA-herstel – ze controleren nieuw geproduceerde strengen op defecte basen en vervangen deze als er fouten worden gevonden.
Voorbeelden van familie A-DNA-polymerasen zijn Pol I, Pol γ (gamma) en Pol θ (theta). Vaak aangeduid als de Pol I-familie (Pol is een afkorting van polymerase), heeft elk subtype een specifieke werking.
Je kunt altijd zien of een DNA-polymerase wordt gevonden in prokaryote of eukaryote cellen door te kijken naar hun namen. Wanneer een polymerase Romeinse cijfers krijgt (Pol III, Pol I, enzovoort), wordt dat enzym aangetroffen in prokaryote (eencellige) organismen. In eukaryoten worden subtypen genoemd volgens het Griekse alfabet (Pol delta, Pol theta, enzovoort). Families kunnen DNA-polymerasen voor eencellige en / of meercellige organismen bevatten.
Pol γ is het enige DNA-polymerase dat mitochondriaal DNA kan repliceren (en alleen familie X DNA-polymerasen voeren mtDNA-reparatie uit).
Pol theta (DNA polymerase theta) herstelt dubbelstrengs breuken in het DNA door de gebroken uiteinden weer samen te voegen. Schade aan het gen dat codeert voor de productie van Pol theta (θ) betekent dat breuken zich opstapelen zonder te worden gerepareerd; theta-gemedieerde end-verbinding (TMEJ) verhoogt echter het risico op mutatie in vergelijking met sommige andere DNA-herstelmechanismen. Hierdoor zijn defecte Pol θ-genen in verband gebracht met vele vormen van kanker.
Door dergelijke studies naar ziekte en DNA hebben familie A DNA-polymerasen ons geholpen verschillende vormen van kanker te begrijpen en te behandelen. Een ander voorbeeld uit de A-familie is Pol nu, dat helpt bij het losmaken van interstrand cross-links (ICL). Wat is een crosslink tussen strengen? Heb je ooit gehoord van mosterdgas, gebruikt in de Tweede Wereldoorlog? Het inademen van dit gas in grote hoeveelheden kan dodelijk zijn, maar duizenden soldaten overleefden de blootstelling. Na verloop van tijd ontdekten artsen dat deze dappere mannen meer kans hadden om te overlijden aan kanker van het ademhalingssysteem dan mensen die nog nooit aan mosterdgas waren blootgesteld.Het gas drong de longen binnen en reageerde direct met het DNA van longcellen, waarbij één nucleotidestreng werd verbonden met tegenoverliggende nucleotiden die niet hun partners waren (diagonale of kruisverbindingen). Deze extra bindingen maakten het uitpakken van DNA vóór replicatie moeilijk en, wanneer replicatie plaatsvond, werden fouten gemaakt bij het kopiëren van de code. Deze fouten vermenigvuldigden zich in de loop van de tijd, waardoor veel DNA-fouten werden gekopieerd en genmutaties veroorzaakten. Deze mutaties leidden tot de productie van defecte cellen of kanker. In het geval van mosterdgas was dit longkanker.
Pol nu (POLν) wordt specifiek geproduceerd om deze zeer schadelijke verknopingen tussen strengen op te lossen. Het wordt niet in grote hoeveelheden gemaakt en lijkt meer een back-upenzym te zijn, maar er kan meer aan de hand zijn. Hoewel pas in 2003 ontdekt, krijgen minder bekende DNA-polymerasen zoals Pol nu veel aandacht. Een van de redenen is dat ongeveer 50% van de borstkankercellen verwijderde gebieden vertonen op de cytogene locatie (positie) 4p16.2 – dat is chromosoom 4, korte arm (p), regio 16, band 2). In de onderstaande afbeelding is dit de positie die het verst naar links staat. Ook belangrijk om op te merken is dat dit precies is waar het gen voor Pol nu-synthese zich bevindt.
Polymerase Familie B-functie
DNA-polymerase B-familie-enzymen zijn belangrijk tijdens het proces van celdeling. Ze controleren nieuw gerepliceerd en gesynthetiseerd DNA. De familie omvat zowel prokaryote als eukaryote polymerasen.
Pol alpha (een Griekse letter, dus een eukaryoot polymerase) zet het DNA-replicatieproces op gang en communiceert beschadigde gebieden met andere B-familie DNA-polymerasen zoals Pol delta en Pol epsilon. Omdat deze fouten onmiddellijk worden verholpen, is de kans veel groter dat ze succesvol zijn en is het risico op reparatie van mismatch (het matchen van de verkeerde nucleotide met een beschadigde DNA-streng) laag.
Een voorbeeld van reparatie van mismatches is de vervanging van een eerder gebonden guanine- en thyminepaar om een guanine- en cytosinepaar in het DNA te produceren, waarbij thymine ten onrechte wordt vervangen door cytosine. Bacteriële en eukaryote DNA-polymerasen staan centraal bij zowel schadeherkenning als schadeherstelmechanismen.
Polymerase Familie C-functie
Hoewel DNA-polymerase C-functies alleen in bacteriën worden aangetroffen, mogen we dat nooit vergeten bacteriën overtreffen de menselijke cellen met tien tegen één op en in het gemiddelde lichaam. De meeste hiervan zijn essentieel voor onze gezondheid, ondersteunen het spijsverteringsstelsel en produceren chemicaliën die de systeem- en orgaanfunctie verbeteren. Minder vaak koloniseren pathogene bacteriën zich om ziektesymptomen te produceren. Familie C – vaak PolC genoemd – is de belangrijkste bacteriële DNA-replicatiepolymerasegroep. Familie C is geen reparatiepolymerase.
Nu medicijnresistente bacteriën in opkomst zijn, worden nieuwe antibacteriële middelen steeds noodzakelijker. Nieuwe onderzoeksgebieden zijn onder meer de ontwikkeling van antibiotica die zich direct op PolC richten. Dit potentiële nieuwe breedspectrummedicijn zou replicatie in alle soorten bacteriën, gezond en pathogeen, kunnen voorkomen, maar nog belangrijker is dat deze medicijnen – die zich nog in de vroegste ontwikkelingsstadia bevinden – de mechanismen vermijden die leiden tot bacteriële antibioticaresistentie.
Polymerase Familie D-functie
Euryarchaeota beschrijft een groep grampositieve en gramnegatieve bacteriën waarvan vaak wordt gezegd dat ze de voorkeur geven aan extreme omgevingen (extremofielen). Deze bacteriën leven en vermenigvuldigen zich echter in allerlei omgevingen, van diep zeeslib tot onze spijsvertering. Ze gebruiken DNA-polymerasen uit de D-familie (PolD) voor DNA-replicatie. Mutatiesnelheden in deze groep zijn erg hoog in vergelijking met die van PolB DNA-polymerasen. En in tegenstelling tot andere polymerasen heeft familie D geen handachtige structuur, waarschijnlijk omdat deze cellen evolutionair gezien zeer vroege celtypen zijn.
Functie Polymerase Familie X
De X familie van DNA-polymerase is beperkt tot eukaryote cellen en speelt zowel replicatieve als herstellende rollen. Sommige werken om mitochondriaal DNA te repareren waar een hoog oxidatieve omgeving DNA-schade aanmoedigt. Anderen repareren één tot (ongeveer) tien opeenvolgende nucleotiden in het DNA van de celkern. De reparatiemethode (base-excisieherstel) in het mitochondrion en de kern is vergelijkbaar. Base excision repair (BER) is een proces waarbij verschillende soorten enzymen worden gebruikt, waaronder DNA-glycosylase en endonucleasen. Het is DNA-polymerase uit de X-familie (Pol beta en Pol lambda) dat de actieve plaats voor deze reparatie vormt en het juiste nucleotide invoegt. Als het gen voor DNA-polymerasen uit de X-familie beschadigd is, worden BER-processen negatief beïnvloed en dit wordt geassocieerd met bepaalde soorten kanker.Sommige nieuwe gerichte therapieën die voor deze kankers zijn ontwikkeld, remmen defecte herstelmechanismen voor basale excisie.
Polymerase Family Y-functie
De DNA-polymerase Y-familie is een replicatief en reparatie-enzym dat wordt aangetroffen in eukaryote en prokaryote cellen. Al deze polymerasen zijn zeer foutgevoelig met betrekking tot hun rol bij de replicatie en onmiddellijke reparatie of omzeiling van defecte DNA-sequenties. Maar tegelijkertijd kunnen te lage niveaus van deze familie van polymerasen iemands gevoeligheid voor kwaadaardige tumoren vergroten. Dit is de reden waarom de Y-familie soms wordt vergeleken met een tweesnijdend zwaard.
De Y-familie-groep wordt geactiveerd wanneer andere DNA-polymerasen geen effect kunnen hebben. Het wordt verondersteld een back-upmechanisme te zijn; dit kan verklaren waarom mutaties na dit type reparatie vaker voorkomen.
Reverse Transcriptase-functie
Virussen, retrovirussen en eukaryote cellen bevatten RNA-afhankelijke reverse transcriptase-enzymen. Deze enzymen – onderdeel van de DNA-polymerasegroep – maken virussen gevaarlijk. Omdat een virus alleen RNA bevat, moet het een micro-organisme of cel misleiden om het te reproduceren. Als onze cellen alleen het RNA zouden kopiëren, zouden ze een of twee ongebruikelijke eiwitten in een ribosoom kunnen produceren, maar deze zouden het virus niet helpen zich te vermenigvuldigen. In plaats daarvan moet het virale RNA op de een of andere manier deel uitmaken van het DNA-sjabloon, zodat de cel permanente veranderingen ondergaat. Het doet dit door reverse transcriptase-enzymen te gebruiken.
Deze enzymen produceren dubbelstrengs DNA van een enkelstrengs RNA-template in een proces dat bekend staat als reverse transcriptie. Mutaties komen vaak voor. De onderstaande afbeelding laat zien hoe het humaan immunodeficiëntievirus zich repliceert in een T-lymfocyt. Omgekeerde transcriptie initieert de groei van het virus door de cel te misleiden om componenten te produceren die zich verzamelen om meer virussen te vormen uit bewerkt DNA.
De meeste reverse transcriptieprocessen zijn het resultaat van schadelijke virale infecties, waarbij het enkelstrengs virale RNA wordt gekopieerd om een dubbele DNA-streng te vormen die vervolgens virale eiwitten gaat maken. Dit wordt gedaan met reverse transcriptase (reverse omdat de gebruikelijke methode is om dubbelstrengs DNA te gebruiken om een enkele streng RNA te produceren).
Testen tijdens de COVID-19 (SARS-CoV-2) in 2020 – zoals bij alle virale infectietesten – vereist virale RNA-extractie. Laboratoria gebruiken een proces dat de reverse transcriptase-polymerase-kettingreactie (rt-PCR) wordt genoemd. Rt-PCR is niet zo ingewikkeld om te begrijpen als het misschien klinkt. Deze test produceert complementair DNA (cDNA) of DNA dat wordt gekopieerd uit kleine hoeveelheden viraal RNA. Aangezien deze procedure slechts zeer kleine hoeveelheden cDNA produceert, moeten de resultaten worden versterkt door het te repliceren. Eenmaal geproduceerd in voldoende hoeveelheden, kan het virale genoom worden gedetecteerd.