Toen de tweede Perzische invasie van Griekenland begon in 481 voor Christus, werd Leonidas gekozen om de gecombineerde Griekse strijdkrachten te leiden, beide vanwege de reputatie van de Spartanen als superieur leger koninkrijk, en vanwege zijn eigen bekwaamheid als generaal. Er wordt gezegd dat de koning het Orakel in Delphi bezocht, dat werd geraadpleegd over belangrijke staatszaken in het hele oude Griekenland, en het Orakel leverde een groot vers dat hem in wezen vertelde dat hij zijn leven moest geven om te voorkomen dat zijn koninkrijk verwoest zou worden. door Perzië.
In augustus 480 v.Chr. marcheerde Leonidas op weg om het leger van de Perzische koning Xerxes te ontmoeten bij Thermopylae, een smalle kustpassage die op de route van de Perzen landinwaarts lag. Hij had slechts 300 elite Spartaanse soldaten en 900 slaven bij zich, waaraan hij toevoegde terwijl hij door andere stadstaten marcheerde en eindigde met een totaal leger van tussen de 4.000 en 7.000 man. Er zijn verschillende verklaringen naar voren gebracht waarom de kracht zo klein was; Herodotus theoretiseerde dat de Spartanen rechtstreeks naar buiten marcheerden, zodat ze geen angst toonden, met de verwachting dat een groter leger zou worden verzameld en snel daarna zou volgen, maar moderne historici geloven dat interne strijd of zelfs het feit dat de Olympische Spelen werden gehouden had destijds de schuld kunnen zijn.
Het Perzische leger waarmee ze geconfronteerd werden, was enorm in aantal. Herodotus ‘schatting van twee miljoen mannen is sindsdien ontkracht, maar het aantal was minstens 70.000 en mogelijk zelfs 300.000. Een patstelling van vier dagen volgde, waarna de Perzen op de vijfde dag vielen. Twee dagen lang hielden de Grieken de Perzen tegen en doodden ongeveer 10.000 van hun mannen, waaronder twee broers van koning Xerxes. Op de zevende dag nam een verrader genaamd Ephialtes contact op met de Perzische generaal Hydarnes en liet hem een verborgen pad zien dat hij kon nemen om achter de Grieken te komen. Wetende dat hij nu overvleugeld was, stuurde Leonidas alle Griekse troepen weg en koos ervoor om in de pas te blijven met zijn 300 Spartanen en de slaven, 400 Thebanen en 700 Thespianen.
Herodotus schreef dat Leonidas de mannen naar ervoor te zorgen dat ze zouden leven om nog een dag te vechten en nuttig zouden zijn in een toekomstige strijd tegen de Perzen, en de Spartanen bleven zowel om de ontsnapping van de Grieken te beschermen als omdat ze nooit hun positie op het slagveld konden verlaten. De Thespians zouden met de andere Grieken zijn weggestuurd, maar bleven uit eigen wil achter.
Xerxes bood naar verluidt aan om het leven van de Spartanen te sparen als ze hun wapens opgaven, waarop Leonidas antwoordde: ” ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(kom en neem ze mee). De mannen vochten toen een bittere laatste stelling tegen de Perzen, en ze werden allemaal gedood behalve de 400 Thebanen, die zich zonder slag of stoot aan de Perzen overgaven. Nadat Leonidas was gedood, vochten de Spartanen om ze terug te halen zijn lichaam en voorkomen dat de Perzen het ontheiligen. Leonidas was ongeveer 60 jaar oud op het moment van zijn dood, en hij werd opgevolgd door zijn zoon Pleistarchus.