Een vergelijkende fenotypische en genomische analyse van C57BL / 6J- en C57BL / 6N-muizenstammen

Genoomsequentievergelijkingen van C57BL / 6N- en C57BL / 6J-muizen voor SNP’s en kleine indels

We gebruikten paired-end alignment van C57BL / 6N naar het referentiegenoom (C57BL / 6J) van het 17 Mouse Genomes Project. De lijst met differentiërende varianten (SNP’s, kleine indels en SV’s) tussen de twee genomen is echter nieuw gemaakt met behulp van nieuwe ingebouwde procedures om de kans te vergroten dat nauwkeurige vermeende sequentieveranderingen worden geïdentificeerd. Een belangrijke analysestap bij het identificeren van een hoogwaardige set varianten van de uitlijning was het gebruik van de nieuw gegenereerde short-read genoomsequentie van C57BL / 6J gegenereerd door het Broad Institute. Hierdoor konden we montagefouten in de referentiesequentie identificeren. Daarnaast hebben we de variantdetectiemethode bijgewerkt: ten eerste door andere en / of meer geëvolueerde software te gebruiken om varianten te detecteren; ten tweede door handmatige curatie uit te voeren op alle coderingsvarianten, en ten derde door uitgebreide validatie van een groot deel van de varianten (inclusief alle coderingsvarianten) om de sequentievoorspellingen te bevestigen. Deze stappen leverden een robuuste dataset van hoogwaardige coderingsvarianten op, waardoor de kans op fout-positieven aanzienlijk werd verminderd.

Om SNP’s en kleine indels te identificeren die de C57BL / 6J- en C57BL / 6N-stammen onderscheiden, gebruikten we de gepaarde- end reads gegenereerd op basis van het 17 Mouse Genomes Project. We noemden varianten met behulp van de Genome Analysis Toolkit (GATK) en vonden 681.220 varianten die de C57BL / 6J- en C57BL / 6N-stammen onderscheiden. Met behulp van de short-read genoomsequentie van C57BL / 6J, gegenereerd door het Broad Institute, waren we in staat om toekomstige sequentiefouten uit te filteren door varianten te verwijderen die veel voorkomen in de Broad C57BL / 6J-sequentie, waardoor discrepanties in de referentie worden tegengegaan en tegelijkertijd het fout-negatieve tarief. De resterende aflezingen werden gefilterd met een allelverhouding van minder dan 0,8 (heterozygoot) en bedekt met minder dan 3 of meer dan 150 aflezingen. Door deze stappen werd de lijst aanzienlijk verkleind, wat resulteerde in 10.794 vermoedelijke varianten die aan verdere analyse werden onderworpen.

Met behulp van Sequenom, PyroSequencing en Sanger-sequencing hebben we alle coderingsvarianten en een subset van de niet-coderende varianten gevalideerd, waaronder 762 SNP’s en 169 kleine indels. Testen werden uitgevoerd met behulp van een panel van vier C57BL / 6J- en vier C57BL / 6N-monsters om genotypen te bevestigen (zie Materialen en methoden). We overwogen een variant te valideren toen alle vier de C57BL / 6J- en C57BL / 6N-monsters consistente genotypen vertoonden binnen een substam en varianten tussen de substammen. Tijdens het validatieproces hebben we 363 varianten geëlimineerd om een aantal redenen, waaronder heterozygote en inconsistente genotypen en PCR-fouten. Voor de overige 568 werden er 236 bevestigd als variant tussen de substammen (zie aanvullend bestand 1, tabel S1).

Met behulp van de annotatieprogramma’s NGS-SNP en Annovar werden de genomische locatie en andere genkenmerken onderzocht. De laatste gevalideerde sequentievarianten tussen C57BL / 6J en C57BL / 6N bestonden uit 34 coderende SNP’s, 2 coderende kleine indels, 146 niet-coderende SNP’s en 54 niet-coderende kleine indels. Coderingsvarianten omvatten 32 missense SNP’s, 1 nonsense-mutatie, 1 splicing-mutatie en 2 frameshift-mutaties (tabel 1). We ontdekten dat alle varianten behalve één (Zp2, chromosoom 7) privé waren voor C57BL / 6J of C57BL / 6N en niet werden gevonden in een van de 16 andere inteeltstammen waarvan de sequentie onlangs is bepaald.

Genoomsequentievergelijkingen van C57BL / 6N- en C57BL / 6J-muizen voor structurele varianten

Nogmaals, gebruikmakend van de gepaarde-end-reads gegenereerd uit het 17 Mouse Genomes Project en een combinatie van vier computationele methoden, identificeerden we 551 SV’s tussen C57BL / 6J en C57BL / 6N. Zoals elders beschreven, hebben we de short-read paired-end mapping visueel geïnspecteerd op deze 551 SV-sites in de 17 gesequentieerde inteeltstammen van muizen en in het Broad J-gesequentieerde genoom. Door dit te doen, waren we in staat om 81 van de 551 sites te behouden voor verdere experimentele analyses (470 voorspelde sites bleken vals te zijn vanwege paired-end mapping-fouten). PCR- en Sanger-gebaseerde sequencinganalyses op deze 81 behouden sites lieten ons toe om nog eens 38 sites te verwijderen, waarvan werd bevestigd dat ze niet-polymorf zijn tussen C57BL / 6J en C57BL / 6N vanwege referentiefouten. Ten slotte werden alle 43 voorspelde varianten gevalideerd als authentieke SV’s die de C57BL / 6J- en C57BL / 6N-stammen differentiëren (tabel 2), resulterend in een nul vals-positief percentage.

Van de 43 SV’s overlappen er 15 met een gen (Tabel 2), waaronder 12 varianten die binnen niet-coderende gebieden van genen liggen, 2 varianten die het coderende gebied van het gen beïnvloeden (Vmn2r65 (Vomeronasal 2, receptor 65) en Nnt (nicotinamide nucleotide transhydrogenase)), en 1 die het hele gen Cyp2a22 beïnvloedt (cytochroom P450, familie 2, subfamilie a, polypeptide 22). Slechts 1 van de 15 varianten is bekend en is al in verband gebracht met een fenotype, Nnt; de overige 14 zijn nieuw, en voor een aantal bespreken we hun potentiële biologische functies hieronder.

Door de rat als een outgroup-soort te gebruiken, hebben we vervolgens de oorsprong van de 43 SV’s tussen C57BL / 6J en C57BL / 6N afgeleid, en ontdekte dat 27 varianten het product waren van retrotranspositie, 15 niet-herhaal-gemedieerde SV’s waren en 1 een variabele nummer tandemherhaling (VNTR) was (tabel 2). Opmerkelijk genoeg waren bijna alle varianten privé voor C57BL / 6J of C57BL / 6N (tabel 2).

Uitgebreide fenotypische beoordeling van C57BL / 6N- en C57BL / 6J-muizen

Parallel aan de genomische analyses heeft het consortium European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) een uitgebreide fenotypische vergelijking gemaakt van de C57BL / 6NTac- en C57BL / 6J-stammen. EUMODIC omvat vier muiscentra die een brede primaire fenotypering uitvoeren van 500 muismutante knock-outlijnen die zijn gegenereerd uit de projecten European Conditional Mouse Mutagenesis (EUCOMM) en Knockout Mouse (KOMP) binnen het IKMC-programma. Cohorten van muizen van elke mutantlijn komen binnen in de European Mouse Phenotyping Resource of Standardized Screens slim (EMPReSSslim) fenotypebepaling, die bestaat uit twee fenotyperingspijplijnen, samen met 20 fenotyperingsplatforms (geïdentificeerd door een ESLIM__procedure_nummer) die worden uitgevoerd van 9 tot 15 weken (zie Extra bestand 2, afbeelding S1). De methoden voor het uitvoeren van elk scherm worden beschreven in de standaard bedieningsprocedures (SOP’s) die te vinden zijn in de EMPReSS-database. Gegevens werden verzameld op 413 fenotype-parameters samen met 146 metadataparameters en ingevoerd in de EuroPhenome-database. Als onderdeel van dit werk hebben we uitgebreide controlegegevens verzameld over het baselinefenotype van C57BL / 6NTac. We hebben ook van deze gelegenheid gebruik gemaakt om het fenotype van C57BL / 6J-muizen te onderzoeken en dit te vergelijken met C57BL / 6NTac (hierna respectievelijk J en N genoemd).

Voor elke lijn, N en J, leeftijd -gelijksoortige muizen zijn geanalyseerd via beide EMPReSSslim-pijplijnen. Gegevens werden verkregen van alle vier centra in het consortium voor 19 van de 20 platforms uit de pijplijn, met uitzondering van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) -analyses (zie aanvullend bestand 2, figuur S1). De EMPReSSslim-protocollen zijn rigoureus gestandaardiseerd in het EUMODIC-consortium; er blijven echter enkele verschillen in bijvoorbeeld uitrusting en voeding, en dit wordt vastgelegd in de metadatasets binnen EuroPhenome. Er zullen natuurlijk andere niet-erkende milieuverschillen tussen centra zijn. Gezamenlijk kunnen deze bijdragen aan verschillen in genomgeving en fenotype-uitkomst, maar we hebben niet geprobeerd om deze effecten systematisch te definiëren, maar in plaats daarvan te focussen op fenotypes die concordant zijn tussen centra en duidelijk robuust zijn voor niet-herkende omgevingsverstoringen. Gegevens van de N- en J-cohorten van elk centrum werden gedeponeerd in EuroPhenome en zijn onderworpen aan een statistische analyse voor elk centrum (zie Materialen en methoden). Het is belangrijk op te merken dat vergelijkingen tussen N en J werden uitgevoerd binnen, niet tussen centra. Statistische analyse van resultaten tussen centra werd niet uitgevoerd, omdat experimenten niet volledig konden worden gecontroleerd tussen centra vanwege omgevings- en andere variabelen en verschillen in het aantal geanalyseerde dieren in elk centrum (zie aanvullend bestand 3, figuur S2a-d). We kozen daarom voor een benadering die zich richtte op stamvergelijkingen binnen individuele centra, in plaats van een statistisch model met meerdere centra te genereren dat een algemeen statistisch verschil tussen de twee stammen onderzocht. De replicatie van de N- en J-vergelijking over meerdere centra gaf ons echter extra kracht bij het onderbouwen van significante fenotypische verschillen tussen de twee stammen. Naast de analyse van N en J via de EMPReSSslim-pijplijn voor primaire fenotypering in de vier centra, hebben andere partners binnen het EUMODIC-consortium een breder scala aan, vaak meer geavanceerde fenotyperingstests toegepast om aanvullende informatie te verzamelen, waarvan sommige verder onderzoeken en onderbouwen van de fenotypische verschillen die door EMPReSSslim worden onthuld.

Bij het analyseren van de gegevens hebben we ons eerst gericht op het identificeren van fenotypeparameters die een consistent en significant verschil lieten zien tussen N en J in drie of meer centra.We identificeerden 27 fenotype-parameters in deze klasse (Figuur 1a; zie Extra bestand 3, Figuur S2a, e). In verschillende gevallen werden deze verschillen ondersteund door gegevens uit secundaire analyse, en we bespreken deze gevallen hieronder. We hebben ook een tweede klasse van parameters ontdekt waarvoor vergelijkbare trends in twee centra werden gezien, maar geen bewijs van trends in de andere twee centra (figuur 1b; zie aanvullend bestand 3, figuur S2b, f). Onze statistische analyse (zie Materialen en methoden) geeft echter aan dat voor deze klasse van parameters de algehele significantie van N versus J-verschillen laag is, en dat de waargenomen trends met de nodige voorzichtigheid moeten worden behandeld. In verschillende van deze gevallen zijn de waargenomen trends echter consistent met fenotypes die in de eerste klasse van parameters worden aangetroffen. We hebben ook een derde maar kleine klasse parameters geïdentificeerd die zeer significante verschillen vertoonden in twee of meer centra (Figuur 2; zie Extra bestand 3, Figuur S2d, h), maar onverwachts de tegenovergestelde trend in een van de centra. We bespreken de redenen voor deze anomalieën, die in sommige gevallen vermoedelijk voortkomen uit interacties tussen genencentra. De laatste klasse vertegenwoordigt een groot aantal tests waarin we geen consistente en significante verschillen tussen de centra hebben waargenomen, met de conclusie dat dit eerder vals-positieven zijn dan bewijs voor N / J-verschillen (zie aanvullend bestand 3, figuur S2c , g).

Dysmorfologie en oftalmologie

We vonden geen bewijs voor enige grote verschillen in morfologische kenmerken tussen N en J, inclusief röntgenanalyse van het skelet. Er werden echter een aantal oftalmologische verschillen tussen de twee stammen vastgesteld. Analyse van de algemene visuele functies met behulp van de virtuele optokinetische trommel vond verminderd zicht in N vergeleken met J-muizen (N: 0,314 cyclus / graad, 95% BI 0,305 tot 0,323, n = 89; J: 0,399 cycli / graad, 95% BI 0,394 tot 0.404, n = 128; p < 0.001, Student “s t-test). Dit weerspiegelde geen verschillen in lensopaciteit, aangezien kwantitatieve analyse met een Scheimpflug-camera transparante lenzen aantrof in beide stammen (N: 5,2 + 0,5%, n = 10; J: 5,0% + 0,5% opaciteit, n = 10). Witte vlekjes werden gezien in de fundus van N-muizen met een hoge frequentie, die afwezig waren bij J-muizen ( Figuur 3A) Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van de Crb1rd8-mutatie in N-muizen, zoals eerder gerapporteerd, hoewel in ons geval de vlekjes alleen in het ventrale netvlies werden gezien, met variaties in de grootte van de vlek en het getroffen gebied tussen de muizen (Figuur 3A) Verdere studies met plaatselijke fundus-endoscopie toonden aan dat het aantal hoofdvaten variabel was, variërend tussen drie en zeven voor aders en drie en eig. ht voor slagaders (Figuur 3B), en een bepaalde muis kan niet-overeenkomende nummers tussen de twee ogen hebben. Het gemiddelde aantal aders en slagaders was significant hoger (P < 0.001) in J dan in N muizen (Figuur 3C).

Cardiovasculair

Niet-invasieve bloeddrukmetingen (ESLIM_002) toonden aan dat de systolische arteriële druk significant hoger was bij J muizen dan bij N muizen, hoewel de significantie van het effect variabel bleek te zijn tussen geslachten en tussen centra. Bovendien merkten alle centra op dat de hartslag significant hoger was bij N dan bij J muizen.Een secundaire partner binnen het consortium ontdekte echter dat de hartslag onder verdoving significant lager was bij N-muizen dan bij J-mannetjesmuizen, hetgeen tot uiting komt in een lang inter-beat (RR) en QTc-interval. We ontdekten ook dat het hartgewicht genormaliseerd naar de lengte van het scheenbeen (ESLIM_020) significant lager was in N dan in J-muizen in twee van de centra, en deze resultaten werden onafhankelijk bevestigd door secundaire analyse. Verdere studies van de hartstructuur en -functie door middel van echocardiografie en van de contractiele functie van het hart door middel van hemodynamica hebben geen verschillen tussen N en J aan het licht gebracht (gegevens niet getoond).

Metabolisme

Voor indirecte calorimetriemetingen van vrijgevoede muizen (ESLIM_003), vonden we een consistent verschil tussen N en J voor O2-consumptie, CO2-productie en warmteproductie. J-muizen vertoonden een verminderde gasuitwisseling en een lager energieverbruik (warmteproductie of metabolische snelheid) vergeleken met N, dat over het algemeen meer uitgesproken was bij vrouwen. Bij secundaire fenotypering met indirecte calorimetrie op nuchtere maag was er een trend naar lager energieverbruik in J versus N tijdens de nachtperiode. Dit was mogelijk geassocieerd met een verminderde ambulante activiteit in J en een lagere voedselinname in J vergeleken met N tijdens de nachtperiode, vooral bij hervoeding (gegevens niet getoond). Er was geen consistent verschil in activiteit in het vrij gevoede calorimetriescherm (ESLIM_003) in de twee centra waar de activiteit werd gemeten (zie aanvullend bestand 3, figuur S2c, g). Vereenvoudigde intraperitoneale glucosetolerantietests (IPGTT’s) (ESLIM_004) toonden een verminderde glucosetolerantie bij J versus N-muizen. Deze waarnemingen van het glucosemetabolisme zijn consistent met de bekende deletie van het Nnt-gen dat specifiek is voor J-muizen, waarvan is aangetoond dat het een rol speelt bij de regulatie van de insulinerespons in bètacellen van de pancreas.

Dual energy X -ray absorptiometrie (DEXA) lichaamssamenstelling en botdensitometrie metingen (ESLIM_005) toonden aan dat N muizen een verhoogde vetmassa hebben (zowel absoluut als genormaliseerd naar gewicht). Bovendien gaven DEXA-metingen aan dat J-muizen een verhoogde vetvrije massa hebben vergeleken met N. In twee van de centra waren de metingen van de botmineraaldichtheid hoger bij J mannelijke muizen; deze bevinding werd echter niet gerepliceerd in het derde centrum dat DEXA-screening uitvoerde. We gingen verder met het uitvoeren van microcomputertomografie (μCT) -analyse van de twee stammen (Figuur 4) en ontdekten dat de corticale dikte, de corticale porositeit en het trabeculair botvolume onveranderd waren tussen N en J.Bovendien analyseerden we verschillende microarchitecturen. parameters gaven aan dat het algehele trabeculaire netwerk vergelijkbaar was. Ten slotte konden metingen van botvorming en resorptiemarkers geen verschillen tussen de twee stammen aan het licht brengen (Figuur 4).

Neurologisch, gedragsmatig en sensorisch

Twee centra toonde grote en consistente verschillen tussen N en J in activiteit in het open veld (ESLIM_007) (Figuur 2), inclusief hogere activiteit bij J-muizen zoals gemeten door afgelegde afstand, en een hoger aantal centrumingangen, indicatief voor verminderde angst. Deze verschillen zijn in overeenstemming met gegevens die onlangs zijn gerapporteerd over een gedragsvergelijking van N en J. Interessant genoeg waren de belangrijkste effecten beperkt tot mannen in de twee centra. Onverwacht werd in een derde centrum het omgekeerde gezien, waarbij N-muizen actiever waren dan J, hoewel deze effecten zowel bij mannen als bij vrouwen werden waargenomen. Een vierde centrum detecteerde deze effecten niet en vond geen significante verschillen. De centra gebruikten allemaal de EMPReSSslim SOP voor de procedure, die een vereiste omvatte voor arena’s van vergelijkbare grootte, maar er waren enkele operationele verschillen tussen de centra, waaronder het gebruik van een- of meervoudige kamers om de arena’s te huisvesten; arena’s met transparante of ondoorzichtige zijkanten; en de afwezigheid of aanwezigheid van omgevingsverrijking in thuiskooien (waarvan bekend is dat het een effect heeft op gedragsresultaten). Geen van deze variabelen was echter consistent met de verschillende waarnemingen tussen centra.We kunnen echter invloeden van het darmmicrobioom, die naar verwachting verschillen tussen centra, niet uitsluiten. Het is bekend dat het darmmicrobioom de werking en het gedrag van het centrale zenuwstelsel beïnvloedt, voornamelijk via de hypothalamus-hypofyse-bijnier-as. We concluderen dat onder bepaalde omstandigheden significante verschillen in open-veldparameters tussen N en J kunnen worden gezien, maar de aard van deze verschillen is gevoelig voor onbekende omgevingsomstandigheden. Het is interessant dat de belangrijkste tegenstrijdige bevinding in de N- versus J-fenotypes beperkt was tot een gedragsfenotyperingsplatform. Daarentegen hebben we voor de meeste andere tests (afgezien van enkele hematologische en klinische chemieparameters, zie hieronder) geen inconsistenties gevonden, wat aangeeft dat gedragsanalyses in tegenstelling tot de meeste fenotyperingsplatforms acuut gevoelig kunnen zijn voor omgevingsparameters.

We hebben ook een licht / donker-overgangstest uitgevoerd om angst bij N- en J-stammen te vergelijken (Figuur 5). We vonden geen significante verschillen tussen N- en J-muizen in het aantal licht-donkerovergangen of in het percentage tijd doorgebracht in het donkere compartiment. De latentie om het donkere compartiment binnen te gaan was echter significant hoger bij N-muizen. Gewijzigde SHIRPA (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phenotype Assessment) testen (ESLIM_008, Figuur 1a) in alle vier centra gaven aan dat mannelijke J-muizen een significant verhoogde locomotorische activiteit hadden, wat correleerde met de bevindingen van grotere afgelegde afstand in testen in het open veld in sommige centra (zie hierboven).

We hebben een aantal tests uitgevoerd die motorische vaardigheden weerspiegelen. Verschillen in grijpkracht (ESLIM_009) werden gezien in alle centra waarbij J hoger was dan N, maar de getroffen parameters waren verschillend, waarbij sommige centra verschillen in de grijpkracht van de voorpoot rapporteerden en sommige voor de gecombineerde grijpkracht van de voorpoot en de achterpoot (Figuur 1a). , b). Rotarod-testen (ESLIM_010) toonden significante verschillen in latency te vallen over alle centra, hoewel de verminderde motorische vaardigheid van N alleen werd waargenomen bij vrouwen in twee van de centra. We hebben de motorische vaardigheden in mannelijke N- en J-muizen verder onderzocht door de motorische leerprestaties op de rotarod gedurende 4 dagen te onderzoeken (Figuur 5). Terwijl de motorische prestaties van J-muizen aanzienlijk verbeterden van dag 1 tot dag 2, verbeterden de prestaties van N-muizen slechts geleidelijk en verschilden significant van de metingen op dag 1 pas vanaf dag 3 (P < 0,05) en verder. Bovendien waren er van dag 2 tot dag 4 zeer significante verschillen in de latentie om te vallen tussen N en J. De primaire tests die in de centra werden uitgevoerd, brachten dus een mogelijk verminderde motorische prestatie in N aan het licht, die werd bevestigd en verder uitgewerkt door meer geavanceerde tests. van motorische leerprestaties.

We hebben ook twee aanvullende gedragstesten uitgevoerd om N versus J-verschillen verder uit te werken. Ten eerste vergeleken we de prestaties van N en J in de Morris-waterlabyrinttest die werd gebruikt om het ruimtelijk geheugen te beoordelen. N mannelijke muizen vertoonden zeer significant verminderde prestaties (hogere latentie) in vergelijking met J mannelijke muizen (Figuur 6). Ten tweede onderzochten we emotioneel leren of geheugen voor een aversieve gebeurtenis met behulp van de cue en contextuele angstconditioneringstests; hier vonden we echter geen significante verschillen tussen de twee stammen (gegevens niet getoond).

Onderzoek naar akoestische schrik- en pre-pulsremming (ESLIM_011) (Figuur 1a) in de twee stammen identificeerde een verscheidenheid aan parameters die significant en consistent verschilden tussen centra. Akoestische schrikreactie magnitude bij 110 dB en schrikreactie magnitude op pre-puls en puls (PP1-PP4 + puls, zie EMPReSSslim) waren verminderd in N vergeleken met J, hoewel dit effect niet werd gezien bij vrouwen in één centrum. In overeenstemming met deze waarnemingen ontdekten we dat pre-pulsinhibitie verschilde tussen N en J, met pre-pulsremming bij PP2 en PP3 en globale remming toenam in N vergeleken met J. een of twee centra (Figuur 1b; zie Extra bestand 3, Figuur S2b, f) maar er werden geen verschillen gezien in andere centra. De waarnemingen over de omvang van de schrik werden niet verstoord door verschillen in gehoor, aangezien we auditieve drempels in zowel J- als N-muizen beoordeelden met behulp van de auditieve hersenstamresponstest en geen verschillen vonden (gegevens niet getoond).

Klinische chemie

Uitgebreide panelen van klinische chemietests werden uitgevoerd op plasmamonsters die aan het einde van elke fenotyperingspijplijn waren verzameld. Het bloedmonster aan het einde van Pijpleiding 1 (ESLIM_021) werd verzameld na een nacht vasten, terwijl het monster aan het einde van Pijpleiding 2 (ESLIM_015) afkomstig was van een vrijgevoed dier.Gegevens die van ten minste drie centra overeenkwamen, toonden aan dat ureum en de elektrolyten natrium, kalium en chloride significant hoger waren in plasma van J-muizen in vergelijking met N-muizen (Figuur 1a), hoewel er enkele duidelijke interacties tussen het geslachtscentrum waren. Gegevens voor vrijgevoede en nuchtere plasmaglucosespiegels gaven aan dat voor elke test ten minste twee centra vonden dat de plasmaglucosespiegels hoger waren in N dan in J-muizen (Figuur 1b). Het is echter bekend dat bloedglucosespiegels worden beïnvloed door het hanteren van dieren, het verwerken van monsters en het gebruik van anesthetica. De gegevens die hier worden gepresenteerd, zijn allemaal afkomstig van monsters die zijn verzameld onder gasvormige isofluoraanverdoving, afgezien van één centrum waarin monsters zijn verzameld onder ketamine / xylazine-injectie (zie figuur 1). Zoals hierboven besproken, lijkt het, vanwege hun bekende verminderde insulinesecretie, tegenstrijdig dat J-muizen lagere plasmaglucosespiegels hebben dan N-muizen, maar de deletie in Nnt lijkt alleen de glucoseklaring te beïnvloeden, en nuchtere of niet-geprikkelde J-muizen geen constante hyperglycemie hebben. Verschillende andere parameters bleken hoger te zijn in J dan in N-muizen in ten minste twee centra, maar in elk geval meldden de andere centra (en) geen significante verschillen in dezelfde parameters (Figuur 1b), bijvoorbeeld vrije vetzuren. Twee centra ontdekten dat ijzer significant hoger was bij N-mannen en dat alkalische fosfatase significant hoger was bij J-mannen. Een van deze centra vond hetzelfde ook bij vrouwen (figuur 2). Gegevens voor elk van deze parameters van een derde centrum zijn echter in tegenspraak met deze bevindingen.

Hematologie

Aan het einde van Pipeline 2 (ESLIM_016) werden verschillende hematologische parameters gemeten. Significante veranderingen in een aantal parameters werden gevonden door twee centra, maar deze resultaten werden niet gerepliceerd in de andere, waaronder het aantal witte en rode bloedcellen, het gemiddelde celvolume en het gemiddelde corpusculaire hemoglobine (Figuur 1b). Tegenstrijdige resultaten werden verkregen voor hematocriet- en gemiddelde celhemoglobineconcentratietests (Figuur 2). In beide gevallen waren de gegevens van twee centra het eens, terwijl een derde centrum het tegenovergestelde effect vertoonde. Dit kan mogelijk het gevolg zijn van de verschillende machinale technologieën die worden gebruikt voor hematologische metingen in de deelnemende klinieken, zoals vastgelegd in de metadata.

Immuunfunctie en allergie

We hebben een aantal secundaire fenotypes onderzocht inclusief gastheerresistentie tegen Listeria monocytogenes in de J- en N-stammen. Vrouwtjes van beide stammen waren gevoeliger voor L. monocytogenes-infectie; het geslachtsverschil in gevoeligheid voor Listeria-gastheer was echter minder uitgesproken in N dan in J. Mannetjes van de N-stam vertoonden verbeterde klaring van Listeria op dag 4 na infectie vergeleken met J-mannen. Dit correleert met een verhoogde pro-inflammatoire respons bij N-mannen op dag 3 na infectie vergeleken met J-mannen (Figuur 7).

We hebben ook N- en J-muizen getest op door dinitrofluorbenzeen (DNFB) geïnduceerde contactovergevoeligheid (CHS). Significante verschillen in de CHS-respons werden geïdentificeerd tussen de twee muizenstammen, waarbij J een verhoogde CHS-respons vertoonde. Opvallend was dat vrouwelijke muizen van beide stammen een verhoogde CHS vertoonden in vergelijking met mannelijke muizen. Onderzoek naar de responsiviteit van natural killer (NK) -cellen op verschillende stimuli toonde aan dat een grotere fractie van NK-cellen wordt geactiveerd door interleukine (IL) -12 alleen of in combinatie met IL-2 in J vergeleken met N-muizen; nogmaals, deze respons was significanter bij vrouwen (Figuur 8).