Het p53-pad: positieve en negatieve feedback-lussen

Een verscheidenheid aan studies in de literatuur heeft 10 positieve of negatieve feedback-lussen in het p53-pad geïdentificeerd (zie figuren 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10). Elk van deze lussen creëert een circuit dat is samengesteld uit eiwitten waarvan de activiteiten of synthesesnelheden worden beïnvloed door de activering van p53, en dit resulteert op zijn beurt in de verandering van de p53-activiteit in een cel. Hiervan zijn er zeven negatieve terugkoppelingslussen die p53-activiteit omlaag moduleren (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyclin G, Wip-1 en Siah-1) en drie zijn positieve terugkoppelingslussen (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF en Rb) die de p53-activiteit moduleren. Al deze netwerken of circuits zijn autoregulerend in die zin dat ze ofwel worden geïnduceerd door p53-activiteit op transcriptieniveau, transcriptioneel worden onderdrukt door p53 (p14 / 19 ARF, figuur 3) of worden gereguleerd door p53-geïnduceerde eiwitten. Zes van deze feedbackloops werken via MDM-2 (MDM-2, cyclin G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT en Rb) om p53-activiteit te moduleren.

Een opwindende bevinding is dat het p53-pad nauw verbonden is met andere signaaltransductie routes die een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van kanker. Een van de eerste onderzochte verbindingen betreft p14 / p19ARF en MDM-2. Het p14 / 19 ARF-eiwit bindt aan het MDM-2-eiwit en moduleert zijn ubiquitine-ligase-activiteit, waardoor de niveaus van het p53-eiwit worden verhoogd (Honda en Yasuda, 1999) (Figuur 3). De transcriptie van het p14 / 19 ARF-gen wordt positief gereguleerd door E2F-1 (Zhu et al., 1999) en beta-catenine (Damalas et al., 2001) en negatief gereguleerd door p53 zelf. Bovendien worden de niveaus van p14 / 19 ARF-eiwit verhoogd door Ras- en Myc-activiteiten in een cel (Figuur 3). De complexiteit van de regulering van p53 door p14 / p19 ARF is onlangs herzien (Lowe en Sherr, 2003). De p14 / 19 ARF-MDM-2-complexen zijn vaak gelokaliseerd in de nucleolus van de cel vanwege de nucleolaire lokalisatiesignalen die aanwezig zijn in p14 / p19 ARF. De nucleolus is de plaats van ribosomale biogenese en p14 / 19 ARF-activiteit zelf kan de snelheid van RNA-verwerking van de ribosomale RNA-precursor in rijpe ribosomale subeenheden veranderen (Sugimoto et al., 2003). Aldus speelt p14 / 19 ARF door het beheersen van MDM-2 en p53 niveaus en dit te coördineren met ribosomale biogenese een belangrijke rol bij de regulering van de celcyclus. Dit is onlangs versterkt door de demonstratie dat het p14 / 19 ARF-eiwit ook Myc-activiteit kan reguleren (en dus celgrootte) (Datta et al., 2004). De MDM-2 in de nucleolus is echter geen passieve entiteit. Van het MDM-2-eiwit is aangetoond dat het specifiek bindt aan drie grote ribosomale subeenheid-eiwitten L5, L11 en L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), en de binding van L5 (Dai en Lu, 2004) of L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) aan MDM-2 verlaagt de ubiquitine-ligase-activiteit. Bovendien bindt het ringvingerdomein van MDM-2 specifiek aan een RNA-sequentie die wordt aangetroffen in de grote ribosomale RNA-subeenheid (Elenbaas et al., 1996). Hoewel al deze waarnemingen wijzen op een centrale rol voor MDM-2 en p14 / 19 ARF in de regulatie van ribosoombiogenese en de celcyclus, begrijpen we niet hoe deze observaties samenkomen om deze regulerende lus te vormen.

Het Rb-eiwit kan worden gevonden in cellen in een complex met MDM-2 en p53, wat resulteert in een hoge p53-activiteit en verhoogde apoptotische activiteit (Xiao et al., 1995). Hoge niveaus van actief E2F-1 dat niet aan Rb is gebonden, schakelt de p53-respons om van G-1-arrestatie naar apoptose. Zowel Rb als MDM-2 worden gefosforyleerd en geremd door cycline E-cdk2 (Figuur 4). Wanneer p53 wordt geactiveerd, stimuleert het de synthese van het p21-eiwit, dat de cycline E-cdk2-activiteit remt, en dit werkt op zijn beurt in op het Rb-MDM-2-complex dat p53-activiteit en apoptose bevordert. Na DNA-schade worden zowel het MDM-2-eiwit als het p53-eiwit gemodificeerd door het ATM-eiwitkinase (Figuur 4). Dit verhoogt de p53-activiteit op dezelfde manier als het p53-MDM-2-Rb-complex de p53-functie verhoogt en proapoptotisch is. Voor een gedetailleerd recent overzicht van de p53-Rb-E2F1-as, zie Yamasaki (2003).

Een deel van de activering van het p53-eiwit omvat de fosforylering van het p53-eiwit bij serines die zich op residuen 33 en 46 bevinden door het p38 MAP-kinase (Figuur 5). Dit p38 MAP-kinase wordt zelf geactiveerd door fosforylering (gereguleerd door de Ras-Raf-Mek-Erk-route) die kan worden omgekeerd of geïnactiveerd door de Wip-1-fosfatase. Wip-1 is een p53-responsief of p53-gereguleerd gen dat een negatieve autoregulatoire lus vormt en de p53- en Ras-routes verbindt (Takekawa et al., 2000) (Figuur 5). Een geactiveerd p53-eiwit reguleert positief de transcriptie van de ubiquitine-ligase Siah-1 (Fiucci et al., 2004), die op zijn beurt het beta-catenine-eiwit afbreekt (Iwai et al., 2004) (Figuur 6). Beta-catenine-niveaus kunnen het p14 / 19 ARF-gen reguleren, dat op zijn beurt MDM-2 negatief reguleert en resulteert in hogere p53-niveaus (een positieve feedbacklus) (Figuur 6). Siah-1 verbindt dus de Wnt-beta-catenine-APC-route met de p53-route. In sommige celtypen induceert het p53-eiwit de transcriptie van het PTEN-gen (Figuur 7). Het PTEN-eiwit is een PIP-3-fosfatase. PIP-3 activeert het AKT-kinase, dat een aantal anti-apoptotische eiwitsubstraten heeft, waaronder het MDM-2-eiwit. Fosforylering resulteert in de translocatie van MDM-2 naar de kern waar het p53 inactiveert (Figuur 7). Dit verbindt de p53-route met de IGF-1-AKT-route en vormt een positieve feedbacklus voor verbeterde p53-activiteit en verminderde AKT-activiteit. Deze lus in p53-regulering is ook onlangs herzien (Gottlieb et al., 2002). Deze positieve en negatieve feedbacklussen bereiken twee dingen: (1) ze moduleren de p53-activiteit in de cel en (2) ze coördineren de p53-activiteit met andere signaaltransductieroutes die het binnengaan van de cel in de celcyclus reguleren (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenine, IGF-1 en cycline E-cdk2-activiteiten).

Er zijn twee extra p53 autoregulerende circuits die een negatieve feedback geven op de p53-functie. Een van de meest actieve van de p53-responsieve genen is het cycline G-gen. Het wordt snel getranscribeerd naar hoge niveaus na p53-activering in een grote verscheidenheid aan celtypen (Okamoto en Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). Het cycline G-eiwit vormt een complex met het PP2A-fosfatase, dat een fosfaatresidu verwijdert uit MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (Figuur 8), dat aan het MDM-2-eiwit wordt toegevoegd door een cdk-kinase (Zhang en Prives, 2001) (Figuur 4). Fosforylering van MDM-2 door cycline A / cdk2 remt zijn activiteit, dus het cycline G-PP2A-fosfatase verhoogt de MDM-2-activiteit en remt p53. Muizen met het cycline G-gen uitgeschakeld zijn levensvatbaar (Kimura et al., 2001), en cycline G nul-muizenembryofibroblasten hebben verhoogde p53-eiwitniveaus in afwezigheid van stress (Okamoto et al., 2002), wat aantoont dat deze feedbacklus is operationeel in vivo en werkt in op de basale niveaus van p53 in een cel, niet alleen op de hogere door p53 geactiveerde niveaus na stress. De tweede negatieve terugkoppelingslus betreft een lid van de p53-familie van transcriptiefactoren, waaronder p53, p63 en p73 die gerelateerd zijn aan structuur en functie en zijn geëvolueerd uit een gemeenschappelijke voorloper. Na een stressreactie wordt het p53-gen geactiveerd, wat op zijn beurt de transcriptie stimuleert van een bepaald gesplitst m-RNA van het p73-gen, genaamd p73 delta N (Figuur 9). Dit vertaalt een p73-eiwit zonder zijn amino-terminale domein. Alle drie de p53-eiwitfamilie hebben vergelijkbare domeinstructuren die zijn samengesteld uit een N-terminaal transcriptieactiveringsdomein dat is gekoppeld aan een centraal kerndomein dat bindt aan een specifieke DNA-sequentie die hierboven is besproken. Alle drie de transcriptiefactoren van de p53-familie herkennen dezelfde DNA-sequentie, ook al zijn p53, p63 en p73 in staat om verschillende transcriptieprogramma’s te initiëren. Er is echter een groot aantal gemeenschappelijke genen die door alle drie de eiwitten kunnen worden gereguleerd, zoals onlangs besproken in Harms et al. (2004).Dus wanneer p53 de transcriptie van p73 delta N activeert, kan het p73 delta N-eiwit binden aan veel van de p53-gereguleerde genen, maar de afwezigheid van een transactiveringsdomein zorgt ervoor dat het werkt als een onderdrukker of concurrent van p53-transcriptieactivering. Op deze manier wordt een negatieve feedbacklus gecreëerd en neemt de activiteit van p53 af (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (Figuur 9). Vijf van deze positieve of negatieve feedbackcircuits (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) omvatten dus genen en eiwitten die centrale leden zijn van andere signaaltransductieroutes, terwijl twee (cycline G en p73 delta N) directe negatieve terugkoppelingslussen vormen.

De uiteindelijke negatieve terugkoppelingslussen die worden besproken, komen in de vorm van ubiquitine-ligasen. Verrassend genoeg lijken er drie verschillende p53-ubiqutine-ligase-activiteiten te zijn (MDM-2, Cop-1 en Pirh-1), die elk een autoregulerende lus vormen die resulteert in lagere p53-activiteit (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (Figuur 10). Elk gen wordt transcriptioneel geactiveerd door p53. Waarom er dit niveau van ontslag is, is op dit moment onduidelijk. Meerdere mogelijkheden zijn dat deze genproducten tot expressie komen of optimaal werken in verschillende cel- of weefseltypen of zelfs in verschillende stadia van ontwikkeling. De MDM-2 knock-out-muis is bijvoorbeeld ongeveer 6 dagen na de bevruchting dodelijk bij implantatie van de blastocyst. Dit kan worden veroorzaakt door de hypoxie die in dat stadium moet optreden, waarbij p53 wordt geactiveerd in afwezigheid van MDM-2 en apoptose veroorzaakt. Consistent met deze interpretatie is de waarneming dat een p53, MDM-2 dubbele knock-outmuis levensvatbaar is en net zo normaal wordt geboren als een p53-knock-outmuis (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Dit is daarom consistent met het idee dat het MDM-2-eiwit werkt zonder een back-up ubiquitine-ligase-activiteit in het blastocyststadium, maar deze andere eiwitten kunnen een meer normale functie in latere ontwikkelingsstadia mogelijk maken. Deze ideeën zijn nu toetsbaar. Het is ook mogelijk dat een of meer van deze drie ubiquitine-ligasen betrokken zijn bij het handhaven van p53-spiegels in de niet-gespannen of basale toestand, terwijl andere alleen werken nadat een door stress geïnduceerde p53 is geproduceerd. De geactiveerde p53- en de door stress geïnduceerde p53-eiwitten hebben zeer verschillende eiwitmodificaties en de impact hiervan op de activiteit van MDM-2, Cop-1 of Pirh-2 is momenteel onduidelijk. Het lijkt waarschijnlijk dat elk van deze drie ubiquitine-ligasen eiwitcomplexen in de cel vormen en dat de bijbehorende eiwitten voor elk van deze ligasen kunnen verschillen, waardoor ze met verschillende regulerende circuits worden verbonden. Op dit moment is er veel bekend over MDM-2 en is er relatief weinig aandacht voor de rol van Cop-1 en Pirh-2, die pas het afgelopen jaar in de literatuur zijn gerapporteerd. Bovendien werd zeer recentelijk aangetoond dat p53 het substraat is van weer een ander E3-ubiquitine-ligase-enzym, topors (Rajendra et al., 2004). Het moet nog worden bepaald of topors ook een transcriptiedoelwit zijn van p53, en dus moeten worden toegevoegd aan de groeiende lijst van eiwitten die bijdragen aan autoregulatoire controle van de p53-route. De komende jaren van onderzoek zouden deze vragen moeten beantwoorden.

Zoals hierboven vermeld, is MDM-2 bij veel van de reguleringskringen betrokken, waarmee de centrale rol van MDM-2 bij de controle van p53-activiteit wordt benadrukt. Een genetische analyse van p53- en MDM-2-mutaties die dit eiwitcomplex blokkeren, heeft kritische aminozuurresiduen in elk eiwit geïdentificeerd die belangrijk zijn voor deze bindingsinteractie (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Van dezelfde aminozuurresiduen is aangetoond dat ze deze eiwitcontacten maken in de kristalstructuur van het amino-uiteinde van HDM-2 (het menselijke eiwit) en een peptide van het amino-uiteinde van p53 (Kussie et al., 1996) . Residuen fenyalanine 19, tryptofaan 23 en leucine 26 van p53 vormen de belangrijkste contacten in de MDM-2 hydrofobe pocket. Fosforylering van residuen serine 20 en mogelijk serine 15 zou deze contacten moeten verzwakken, en peptiden en geneesmiddelen die met deze contacten concurreren, blokkeren het p53 MDM-2-complex en bevorderen apoptose in cellen (Klein en Vassilev, 2004). Het p53-MDM-2-complex en de MDM-2-ubiquitine-ligase-activiteit zijn dus een belangrijk geneesmiddeldoelwit geworden voor sommige kankers. Bij ongeveer een derde van de menselijke sarcomen en bij sommige leukemieën en glioblastomen is het HDM-2-gen geamplificeerd en komt dit eiwit tot overexpressie. Het p53-gen is een wild-type en het p53-eiwit is blijkbaar inactief, zodat geneesmiddelen die het p53-HDM-2-complex breken, p53 moeten activeren. Bovendien lijken veel andere kankers het HDM-2-genproduct op hoge niveaus tot expressie te brengen, zelfs wanneer het HDM-2-gen niet wordt geamplificeerd. Bij dit soort kankers zou het blokkeren van HDM-2-activiteit of het bevrijden van p53 van dit complex heel goed apoptose kunnen induceren in de kankercellen. Dit zou ook de chemotherapeutische activiteit van sommige geneesmiddelen die p53 activeren, kunnen versterken.

De p53-MDM-2 autoregulatoire lus zal naar verwachting een oscillator opzetten met p53- en MDM-2-niveaus die met de tijd toenemen en afnemen en uit fase in de cel. Dit is eerst aangetoond door het meten van MDM-2- en p53-niveaus met behulp van Western-blots van eiwitten uit cellen in kweek die een p53-stressrespons ondergaan (Lev Bar-Or et al., 2000). Hoewel oscillaties worden waargenomen en in de loop van de tijd worden gedempt, worden in dit experiment de eiwitconcentraties van veel cellen in kweek gemiddeld die uit fase zijn in hun oscillaties, wat aanleiding geeft tot constructieve of destructieve interferentie. Om deze reden werden fluorescent gelabelde p53- en HDM2-fusie-eiwitten afgebeeld in individuele cellen om de veranderingen in p53- en HDM-2-niveaus te volgen in cellen die een p53-stressrespons ondergingen. De verwachte oscillaties uit fase werden waargenomen en verrassend genoeg was het aantal oscillaties in een cel evenredig met de dosis straling die aan deze cellen werd gegeven (Lahav et al., 2004). Dit suggereert dat p53 de intensiteit van een stresssignaal op een digitale manier kan meten (aantal oscillaties) en niet op een analoge manier (hogere p53-concentraties). Vergelijkbare oscillaties zijn waargenomen in andere signaaltransductieroutes die negatieve autoregulerende lussen hebben, zoals de NF-κ-B-route met de NF-κ-B- en I-κ-B-eiwitten (Scott et al., 1993). Deze digitale signalen die het resultaat zijn van oscillaties in de hoeveelheid transcriptiefactoren, zouden heel goed kunnen resulteren in een patroon van periodieke genexpressie. Het blijft echter onduidelijk hoe digitale signalen op het niveau van de transcriptiefactor worden vertaald in analoge signalen op het niveau van de hoeveelheid mRNA die door een gen wordt geproduceerd. Deze experimenten leiden tot de mogelijkheid dat verschillende aantallen oscillaties, de timing of golflengte van de oscillaties of de amplitude van deze oscillaties invloed kunnen hebben op het geselecteerde patroon van genexpressie en het resultaat (stopzetting van de celcyclus, apoptose of veroudering) van de p53. respons.

Waarom zijn er zoveel feedbackloops in het p53-pad? Er zijn veel antwoorden op deze vraag. Mogelijk zijn niet alle mechanismen actief in hetzelfde cel- of weefseltype of in dezelfde ontwikkelingsstadia. Feedbacklussen van het hier beschreven type bieden een middel om de p53-route te verbinden met andere signaaltransductieroutes en de cellulaire signalen voor groei en deling te coördineren. Redundanties in een systeem kunnen soms fouten voorkomen en een back-upsysteem vermindert het fenotype van mutaties. Aan de andere kant kan niet elk van de terugkoppelingslussen getoond in figuren 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10 de tand des tijds en verder experimenteren doorstaan. Veel van deze routes zijn opgehelderd door experimenten die zijn uitgevoerd met kankercellen in kweek die mutaties hebben die deze routes veranderen. Zelfs normale cellen in kweek- of knock-outmuizen (vanwege accommodatie door de mutatie) weerspiegelen mogelijk niet alle omstandigheden die in normale cellen en organen in vivo voorkomen. Het is bijzonder moeilijk om te bewijzen dat een specifiek proteïne kinase of fosfatase in vivo inwerkt op een specifiek substraat en een uitkomst heeft die kwantitatief gemeten kan worden. We moeten dus doorgaan met het testen en uitdagen van de functies en paden waarvan we denken dat ze in een cel werken. Deze constructen, weergegeven in figuren 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10, zijn echter nuttig bij het formuleren van hypothesen en het testen van ideeën die zeker zullen leiden tot nieuwe inzichten in de aard van kankers en het ontwerp van geneesmiddelen en middelen die selectief kankercellen doden.