Calea p53: bucle de feedback pozitive și negative

O varietate de studii din literatură au identificat 10 bucle de feedback pozitive sau negative în calea p53 (a se vedea figurile 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 și 10). Fiecare dintre aceste bucle creează un circuit compus din proteine ale căror activități sau rate de sinteză sunt influențate de activarea p53 și acest lucru duce la modificarea activității p53 într-o celulă. Dintre acestea, șapte sunt bucle de feedback negative care modulează activitatea p53 (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, ciclină G, Wip-1 și Siah-1) și trei sunt bucle de feedback pozitive (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF și Rb) care modulează activitatea p53. Toate aceste rețele sau circuite sunt autoreglatorii în sensul că sunt fie induse de activitatea p53 la nivel transcripțional, reprimate transcripțional de p53 (p14 / 19 ARF, Figura 3), fie sunt reglementate de proteinele induse de p53. Șase dintre aceste bucle de reacție acționează prin MDM-2 (MDM-2, ciclină G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT și Rb) pentru a modula activitatea p53.

O constatare interesantă este că calea p53 este strâns legată de altă transducție de semnal căi care joacă un rol semnificativ în originile cancerului. Una dintre primele conexiuni studiate implică p14 / p19ARF și MDM-2. Proteina ARF p14 / 19 se leagă de proteina MDM-2 și modulează activitatea ubiquitin ligazei sale, crescând nivelurile proteinei p53 (Honda și Yasuda, 1999) (Figura 3). Transcrierea genei ARF p14 / 19 este reglată pozitiv de E2F-1 (Zhu și colab., 1999) și beta-catenină (Damalas și colab., 2001) și reglementată negativ chiar de p53. În plus, nivelurile de proteină ARF p14 / 19 sunt crescute de activitățile Ras și Myc într-o celulă (Figura 3). Complexitatea reglării p53 de p14 / p19 ARF a fost recent revizuită (Lowe și Sherr, 2003). Complexele p14 / 19 ARF-MDM-2 sunt adesea localizate în nucleolul celulei datorită semnalelor de localizare nucleolară prezente în p14 / p19 ARF. Nucleolul este locul biogenezei ribozomale și activitatea ARF p14 / 19 în sine poate modifica rata procesării ARN a precursorului ARN ribozomal în subunități ribozomale mature (Sugimoto și colab., 2003). Astfel, p14 / 19 ARF prin controlul nivelurilor MDM-2 și p53 și coordonarea acestuia cu biogeneza ribozomală joacă un rol important în reglarea ciclului celular. Acest lucru a fost consolidat recent de demonstrația că proteina ARF p14 / 19 poate regla și activitatea Myc (și, prin urmare, mărimea celulei) (Datta și colab., 2004). MDM-2 din nucleol nu este, totuși, o entitate pasivă. S-a demonstrat că proteina MDM-2 se leagă în mod specific la trei proteine mari subunitate ribozomală L5, L11 și L23 (Marechal și colab., 1994; Lohrum și colab., 2003; Zhang și colab., 2003; Dai și colab., 2004 ), iar legarea L5 (Dai și Lu, 2004) sau L11 (Lohrum și colab., 2003; Zhang și colab., 2003) la MDM-2 scade activitatea sa ubiquitin ligază. În plus, domeniul degetului inelar al MDM-2 se leagă în mod specific de o secvență de ARN găsită în subunitatea mare de ARN ribozomal (Elenbaas și colab., 1996). În timp ce toate aceste observații indică un rol central pentru MDM-2 și p14 / 19 ARF în reglarea biogenezei ribozomilor și a ciclului celular, nu înțelegem cum aceste observații se reunesc pentru a forma această buclă reglatoare.

Proteina Rb poate fi găsită în celule dintr-un complex cu MDM-2 și p53, rezultând o activitate p53 ridicată și o activitate apoptotică sporită (Xiao și colab., 1995). Nivelurile ridicate de E2F-1 activ nelegat de Rb comută răspunsul p53 de la oprirea G-1 la apoptoză. Atât Rb, cât și MDM-2 sunt fosforilate și inhibate de ciclina E-cdk2 (Figura 4). Când p53 este activat, stimulează sinteza proteinei p21, care inhibă activitatea ciclinei E-cdk2, iar aceasta la rândul său acționează asupra complexului Rb-MDM-2 care promovează activitatea p53 și apoptoza. După deteriorarea ADN-ului, atât proteina MDM-2, cât și proteina p53 sunt modificate de proteina kinază ATM (Figura 4). Acest lucru îmbunătățește activitatea p53 în același mod în care complexul p53-MDM-2-Rb crește funcția p53 și este proapoptotic. Pentru o revizuire recentă detaliată a axei p53-Rb-E2F1 a se vedea Yamasaki (2003).

O parte din activarea proteinei p53 implică fosforilarea proteinei p53 la serine situate la reziduurile 33 și 46 de către kinaza MAP p38 (Figura 5). Această kinază MAP p38 este activată în sine prin fosforilare (reglementată de calea Ras-Raf-Mek-Erk) care poate fi inversată sau inactivată de fosfataza Wip-1. Wip-1 este o genă receptivă la p53 sau reglată p53 care formează o buclă de autoreglare negativă și conectează căile p53 și Ras (Takekawa și colab., 2000) (Figura 5). O proteină p53 activată reglează pozitiv transcrierea ubiquitin ligazei Siah-1 (Fiucci și colab., 2004), care la rândul său acționează pentru degradarea proteinei beta-cateninei (Iwai și colab., 2004) (Figura 6). Nivelurile de beta-catenină pot regla gena ARF p14 / 19, care la rândul său reglează negativ MDM-2 și are ca rezultat niveluri mai ridicate de p53 (o buclă de feedback pozitivă) (Figura 6). Siah-1 conectează astfel calea Wnt-beta-catenin-APC la calea p53. În unele tipuri de celule, proteina p53 induce transcrierea genei PTEN (Figura 7). Proteina PTEN este o fosfatază PIP-3. PIP-3 activează kinaza AKT, care are un număr de substraturi proteice antiapoptotice, inclusiv proteina MDM-2. Fosforilarea are ca rezultat translocarea MDM-2 în nucleu unde inactivează p53 (Figura 7). Aceasta conectează calea p53 cu calea IGF-1-AKT și formează o buclă de feedback pozitiv pentru o activitate p53 îmbunătățită și o activitate AKT scăzută. Această buclă din reglementarea p53 a fost, de asemenea, recent revizuită (Gottlieb și colab., 2002). Aceste bucle de feedback pozitiv și negativ realizează două lucruri: (1) modulează activitatea p53 în celulă și (2) coordonează activitatea p53 cu alte căi de transducție a semnalului care reglează intrarea celulei în ciclul celular (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenin, IGF-1 și ciclină E-cdk2 activități).

Există două circuite de autoreglare p53 suplimentare care reacționează negativ asupra funcției p53. Una dintre cele mai active dintre genele responsive pentru p53 este gena ciclinei G. Se transcrie rapid la niveluri ridicate după activarea p53 într-o mare varietate de tipuri de celule (Okamoto și Beach, 1994; Zauberman și colab., 1995; Bates și colab., 1996; Yardley și colab., 1998). Proteina ciclină G face un complex cu fosfataza PP2A, care elimină un reziduu de fosfat din MDM-2 (Okamoto și colab., 2002) (Figura 8), care este adăugat la proteina MDM-2 de către o cdk kinază (Zhang și Prives, 2001) (Figura 4). Fosforilarea MDM-2 de către ciclina A / cdk2 îi inhibă activitatea, astfel fosfataza ciclinei G-PP2A îmbunătățește activitatea MDM-2 și inhibă p53. Șoarecii cu gena ciclinei G eliminată sunt viabile (Kimura și colab., 2001), iar fibroblastele embrionului ciclin G nul de șoarece au niveluri ridicate de proteine p53 în absența stresului (Okamoto și colab., 2002), demonstrând că această buclă de feedback este operațional in vivo și acționează asupra nivelurilor bazale de p53 într-o celulă nu numai asupra nivelurilor superioare activate de p53 după stres. A doua buclă de feedback negativ implică un membru al familiei p53 de factori de transcripție, care includ p53, p63 și p73 care sunt legate de structură și funcție și au evoluat dintr-un precursor comun. După un răspuns la stres, gena p53 este activată, care la rândul său stimulează transcrierea unui anumit m-ARN splicat din gena p73, numită p73 delta N (Figura 9). Aceasta traduce o proteină p73 fără domeniul său amino-terminal. Toate cele trei familii de proteine p53 au structuri de domenii similare compuse dintr-un domeniu de activare transcripțională N-terminal legat de un domeniu central de bază care se leagă de o secvență specifică de ADN discutată mai sus. Toți cei trei factori de transcripție ai familiei p53 recunosc aceeași secvență ADN, chiar dacă p53, p63 și p73 sunt capabili să inițieze programe transcripționale distincte. Există, totuși, un număr mare de gene comune care pot fi reglate de toate cele trei proteine, așa cum a fost recent analizat în Harms și colab. (2004).Astfel, atunci când p53 activează transcripția p73 delta N, proteina p73 delta N se poate lega la multe dintre genele reglate p53, dar absența unui domeniu de transactivare îl face să acționeze ca un represor sau concurent al activării transcripționale p53. În acest fel, este configurată o buclă de feedback negativ și activitatea p53 scade (Grob și colab., 2001; Kartasheva și colab., 2002) (Figura 9). Astfel, cinci dintre aceste circuite de feedback pozitiv sau negativ (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) implică gene și proteine care sunt membri centrale ale altor căi de transducție a semnalului, în timp ce două (ciclina G și p73 delta N) formează bucle de feedback negativ direct.

Buclele finale de feedback negativ care vor fi discutate vin sub forma de ligase ubiquitin. În mod surprinzător, pare să existe trei activități diferite ale p53-ubiqutin ligazei (MDM-2, Cop-1 și Pirh-1), fiecare dintre acestea formând o buclă de autoreglare care are ca rezultat o activitate p53 mai mică (Leng și colab., 2003; Dornan și colab ., 2004) (Figura 10). Fiecare genă este activată transcripțional de p53. În prezent, nu este clar de ce există acest nivel de redundanță. Mai multe posibilități sunt ca aceste produse genetice să fie exprimate sau să acționeze optim în diferite tipuri de celule sau țesuturi sau chiar în diferite stadii de dezvoltare. De exemplu, șoarecele knockout MDM-2 este letal la aproximativ 6 zile după fertilizare, chiar la implantarea blastocistului. Acest lucru poate fi declanșat de hipoxia care trebuie să apară în acea etapă, activând p53 în absența MDM-2 și provocând apoptoză. În concordanță cu această interpretare este observația că un șoarece dublu knockout p53, MDM-2 este viabil și se naște la fel de normal ca un șoarece knockout p53 (Jones și colab., 1995; Montes de Oca Luna și colab., 1995). Prin urmare, acest lucru este în concordanță cu ideea că proteina MDM-2 acționează fără o activitate ubiquitin ligază de rezervă în stadiul de blastocist, dar aceste alte proteine ar putea permite o funcționare mai normală în etapele ulterioare ale dezvoltării. Aceste idei sunt acum testabile. De asemenea, este posibil ca una sau mai multe dintre aceste trei ligase ubiquitin să fie implicate în menținerea nivelurilor de p53 în starea non-stresată sau bazală, în timp ce altele acționează numai după ce se produce un p53 indus de stres. Proteinele p53 activate și p53 induse de stres au modificări ale proteinelor foarte diferite și impactul acestora asupra activității MDM-2, Cop-1 sau Pirh-2 este în prezent neclar. Se pare că fiecare dintre aceste trei ligase ubiquitin formează complexe proteice în celulă și proteinele asociate pot diferi pentru fiecare dintre aceste ligase, conectându-le la diferite circuite de reglare. În prezent, se știe foarte multe despre MDM-2 și s-a concentrat relativ puțin pe rolul Cop-1 și Pirh-2, care au fost raportate doar în literatura de specialitate în ultimul an sau cam așa ceva. În plus, foarte recent s-a dovedit că p53 este substratul unei alte enzime E3 ubiquitin ligază, topori (Rajendra și colab., 2004). Rămâne de stabilit dacă toporii sunt, de asemenea, o țintă transcripțională a p53 și, prin urmare, ar trebui adăugat la lista crescândă de proteine care contribuie la controlul autoreglator al căii p53. Următorii câțiva ani de studiu ar trebui să abordeze aceste întrebări.

După cum sa menționat mai sus, multe dintre buclele de reglementare implică MDM-2, evidențiind astfel rolul central al MDM-2 în controlul activității p53. O analiză genetică a mutațiilor p53 și MDM-2 care blochează acest complex proteic a identificat reziduuri critice de aminoacizi în fiecare proteină care sunt importante pentru această interacțiune de legare (Lin și colab., 1994; Freedman și colab., 1997). S-a arătat că aceleași resturi de aminoacizi fac aceste contacte proteice în structura cristalină a capătului amino-terminal al HDM-2 (proteina umană) și a unei peptide din capătul amino-capăt al p53 (Kussie și colab., 1996) . Reziduurile fenialanină 19, triptofan 23 și leucină 26 din p53 formează contactele majore din buzunarul hidrofob MDM-2. Fosforilarea reziduurilor serină 20 și, eventual, serină 15 ar trebui să slăbească aceste contacte, iar peptidele și medicamentele care concurează cu aceste contacte blochează complexul p53 MDM-2 și promovează apoptoza în celule (Klein și Vassilev, 2004). Astfel, complexul p53-MDM-2 și activitatea ubiquitin ligazei MDM-2 au devenit o țintă majoră a medicamentului pentru unele tipuri de cancer. În aproximativ o treime din sarcoamele umane și în unele leucemii și glioblastoame, gena HDM-2 a fost amplificată și această proteină este supraexprimată. Gena p53 este de tip sălbatic, iar proteina p53 este aparent inactivă, astfel încât medicamentele care sparg complexul p53-HDM-2 ar trebui să activeze p53. În plus, multe alte tipuri de cancer par să exprime produsul genei HDM-2 la niveluri ridicate chiar și atunci când gena HDM-2 nu este amplificată. În aceste tipuri de cancer, blocarea activității HDM-2 sau eliberarea p53 din acest complex ar putea induce apoptoza selectiv în celulele canceroase. Acest lucru ar putea spori, de asemenea, activitatea chimioterapeutică a unor medicamente care activează p53.

Bucla de autoreglare p53-MDM-2 este prognozată pentru a configura un oscilator cu niveluri de p53 și MDM-2 crescând și scăzând cu timpul și defazarea în celulă. Acest lucru a fost demonstrat mai întâi prin măsurarea nivelurilor de MDM-2 și p53 folosind Western blots de proteine din celule din cultură care au suferit un răspuns de stres p53 (Lev Bar-Or și colab., 2000). În timp ce oscilațiile sunt observate și se umezesc în timp, acest experiment calculează în medie concentrațiile de proteine din multe celule din cultură care pot fi defazate în oscilațiile lor, dând naștere la interferențe constructive sau distructive. Din acest motiv, proteinele de fuziune p53 și HDM2 marcate fluorescent au fost imaginate în celule individuale pentru a urmări modificările nivelurilor de p53 și HDM-2 în celulele supuse unui răspuns de stres p53. Au fost observate oscilațiile așteptate în fază și surprinzător numărul de oscilații dintr-o celulă a fost proporțional cu doza de radiație dată acestor celule (Lahav și colab., 2004). Acest lucru sugerează că p53 poate măsura intensitatea unui semnal de stres într-un mod digital (numărul de oscilații) și nu într-un mod analog (concentrații mai mari de p53). Oscilații similare au fost observate în alte căi de transducție a semnalului care au bucle de autoreglare negative, cum ar fi calea NF-κ-B cu proteinele NF-κ-B și I-κ-B (Scott și colab., 1993). Aceste semnale digitale rezultate din oscilații în cantitatea de factori de transcripție ar putea avea ca rezultat un model de expresie periodică a genei. Cu toate acestea, modul în care semnalele digitale la nivelul factorului de transcripție sunt traduse în semnale analogice la nivelul cantității de ARNm produs de o genă rămân neclar. Aceste experimente conduc la posibilitatea ca un număr diferit de oscilații, sincronizarea sau lungimea undei oscilațiilor sau amplitudinea acestor oscilații să aibă impact asupra modelului selectat de expresie genetică și asupra rezultatului (stoparea ciclului celular, apoptoză sau senescență) a răspuns.

De ce există atât de multe bucle de feedback în calea p53? Există multe răspunsuri la această întrebare. Este posibil ca toate mecanismele să nu fie active în același tip de celulă sau țesut sau în aceleași etape în timpul dezvoltării. Buclele de feedback de tipul descris aici oferă un mijloc de a conecta calea p53 cu alte căi de transducție a semnalului și de a coordona semnalele celulare pentru creștere și divizare. Redundanțele într-un sistem pot uneori preveni erorile, iar un sistem de rezervă reduce fenotipul mutațiilor. Pe de altă parte, nu toate buclele de feedback prezentate în figurile 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 și 10 pot rezista testului timpului și al experimentării ulterioare. Multe dintre aceste căi au fost elucidate prin experimente efectuate cu celule canceroase în cultură care au mutații care modifică aceste căi. Chiar și celulele normale din șoareci de cultură sau șoareci knockout (datorită acomodării la mutație) pot să nu reflecte toate condițiile care apar în celulele și organele normale in vivo. Este deosebit de dificil să se demonstreze că o protein kinază sau fosfatază specifică acționează asupra unui substrat specific in vivo și are un rezultat care poate fi măsurat cantitativ. Astfel, trebuie să testăm și să provocăm în continuare funcțiile și căile pe care credem că le operează într-o celulă. Cu toate acestea, aceste construcții, prezentate în figurile 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 și 10, sunt utile în formularea ipotezelor și testarea ideilor care vor conduce cu siguranță la noi perspective asupra naturii cancerului și a proiectării medicamentelor și agenți care distrug selectiv celulele canceroase.