Când a început a doua invazie persană în Grecia, în 481 î.Hr., Leonidas a fost ales să conducă forțele grecești combinate, atât datorită reputației spartanilor ca militar superior regat și din cauza propriei sale priceperi ca general. Se spune că regele a vizitat oracolul de la Delfi, care a fost consultat cu privire la chestiuni importante de stat din Grecia Antică, iar oracolul a rostit un verset măreț care, în esență, i-a spus că trebuie să-și dea viața pentru a împiedica regatul său să fie distrus. de Persia.
În august 480 î.Hr., Leonidas a ieșit în întâmpinare cu armata regelui persan Xerxes la Termopile, un pasaj de coastă îngust care se întindea pe ruta persanilor spre interior. Avea cu el doar 300 de soldați spartani de elită și 900 de sclavi, la care adăuga în timp ce pășea peste țară prin alte orașe-state, ajungând la o armată totală de între 4.000 și 7.000 de oameni. Au fost prezentate diverse explicații cu privire la motivul pentru care forța a fost atât de mică; Herodot a teoretizat că spartanii au ieșit direct afară, așa că au fost văzuți să nu arate nici o teamă, cu așteptarea că o armată mai mare va fi adunată și va urma imediat după aceea, dar istoricii moderni cred că au avut loc conflicte interne sau chiar faptul că au avut loc Jocurile Olimpice. la vremea respectivă ar fi putut fi de vină.
Armata persană cu care s-au confruntat era numeroasă. Estimarea lui Herodot de două milioane de bărbați a fost de atunci demisă, însă cifra era de cel puțin 70.000 și, eventual, de până la 300.000. A urmat un impas de patru zile, apoi persanii au atacat în a cincea zi. Timp de două zile, grecii i-au reținut pe persani, ucigând aproximativ 10.000 dintre oamenii lor, inclusiv doi dintre frații regelui Xerxes. În a șaptea zi, un trădător pe nume Ephialtes l-a contactat pe generalul persan Hydarnes și i-a arătat o cale ascunsă pe care ar putea să o ia pentru a ajunge în spatele grecilor. Știind că acum era depășit, Leonidas a trimis toate trupele grecești, alegând să rămână în trecere cu cei 300 de spartani și sclavii săi, 400 de tebani și 700 de teespieni.
Herodot a înregistrat că Leonidas i-a trimis pe bărbați la asigurați-vă că vor trăi pentru a lupta încă o zi și vor fi utili într-o viitoare bătălie împotriva perșilor, iar spartanii au rămas atât pentru a proteja evadarea grecilor, cât și pentru că nu și-ar putea abandona poziția pe câmpul de luptă. Se presupunea că Thespienii au fost trimiși cu ceilalți greci, dar au rămas în voia lor.
Xerxes s-ar fi oferit să scutească viața spartanilor dacă ar renunța la arme, la care Leonidas a răspuns „ ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(veniți și luați-i). Oamenii au luptat apoi cu o dură amărăciune împotriva persilor și toți au fost uciși, cu excepția celor 400 de tebani, care s-au predat persanilor fără luptă. Leonidas avea aproximativ 60 de ani în momentul morții sale și a fost succedat de fiul său, Pleistarh.