O analiză comparativă fenotipică și genomică a tulpinilor de șoarece C57BL / 6J și C57BL / 6N

Compararea secvenței genomice a șoarecilor C57BL / 6N și C57BL / 6J pentru șoareci SNP și indels mici

Am folosit alinierea capătului C57BL / 6N la genomul de referință (C57BL / 6J) din Proiectul 17 genomi de șoarece. Cu toate acestea, lista variantelor de diferențiere (SNP, indels mici și SV) între cele două genomi a fost creată recent folosind noi proceduri încorporate pentru a crește probabilitatea de a identifica modificări corecte ale secvenței putative. Un pas cheie de analiză în identificarea unui set de variante de înaltă calitate din aliniament a fost utilizarea secvenței genomului nou generat de scurtă citire a C57BL / 6J generat de Broad Institute. Acest lucru ne-a permis să identificăm erorile de asamblare în secvența de referință. În plus, am actualizat metoda de detectare a variantelor: mai întâi, utilizând software-uri diferite și / sau mai evoluate pentru a detecta variante; în al doilea rând, prin efectuarea curării manuale a tuturor variantelor de codificare și, în al treilea rând, prin validarea extinsă a unei proporții mari a variantelor (inclusiv toate variantele de codificare) pentru a confirma predicțiile secvenței. Acești pași au furnizat un set de date robust de variante de codare de înaltă calitate, reducând considerabil rata fals-pozitivă.

Pentru a identifica SNP-urile și indel-urile mici care diferențiază tulpinile C57BL / 6J și C57BL / 6N, am folosit citiri finale generate din Proiectul 17 genomi de șoarece. Am numit variante folosind setul de instrumente de analiză a genomului (GATK) și am găsit 681,220 de variante care distinge tulpinile C57BL / 6J și C57BL / 6N. Folosind secvența de genom citită pe scurt a C57BL / 6J generată de Broad Institute, am reușit să filtrăm erorile de secvențiere potențiale prin eliminarea variantelor comune secvenței Broad C57BL / 6J, contracarând astfel discrepanțele din referință, îmbunătățind în același timp falsul negativ rată. Citirile rămase au fost filtrate cu un raport alelic mai mic de 0,8 (heterozigot) și acoperite cu mai puțin de 3 sau mai mult de 150 de citiri. Acești pași au redus semnificativ lista, rezultând 10.794 de variante putative care au fost supuse unor analize suplimentare.

Utilizând secvențierea Sequenom, PyroSequencing și Sanger, am validat toate variantele de codificare și un subset al variantelor necodificate, care a inclus 762 SNP-uri și 169 indels mici. Testele au fost efectuate folosind un panou de patru probe C57BL / 6J și patru probe C57BL / 6N pentru a confirma genotipurile (vezi Materiale și metode). Am considerat o variantă validată atunci când toate cele patru probe C57BL / 6J și C57BL / 6N au prezentat genotipuri consistente într-o sub-tulpină și variante între sub-tulpini. În timpul procesului de validare, am eliminat 363 de variante din mai multe motive, inclusiv genotipuri heterozigote și inconsistente și eșecuri PCR. Pentru restul de 568, 236 au fost confirmate ca variantă între sub-tulpini (a se vedea fișierul suplimentar 1, tabelul S1).

Utilizând programele de adnotare NGS-SNP și Annovar, localizarea genomică și alte caracteristici genetice au fost examinat. Variantele finale de secvență validate între C57BL / 6J și C57BL / 6N au constat din 34 SNP-uri codificatoare, 2 indels mici care codifică, 146 SNP necodificatori și 54 indels mici care nu codifică. Variantele de codare au inclus 32 de SNP-uri fără sens, 1 mutație fără sens, 1 mutație de splicing și 2 mutații framehift (Tabelul 1). Am constatat că toate variantele, cu excepția uneia (Zp2, cromozomul 7), erau private fie pentru C57BL / 6J, fie pentru C57BL / 6N și nu au fost găsite în niciuna dintre cele 16 alte tulpini consangvinizate recent secvențiate.

Comparația secvenței genomice a șoarecilor C57BL / 6N și C57BL / 6J pentru variante structurale

Din nou, folosind citirile de capăt împerecheate generate din Proiectul 17 genomi de șoarece și o combinație de patru calcule metode, am identificat 551 SV între C57BL / 6J și C57BL / 6N. Așa cum s-a descris în altă parte, am inspectat vizual cartografierea cu capăt pereche de scurtă citire la aceste 551 de situsuri SV în cele 17 tulpini consangvinizate de șoareci și în genomul secvențiat Broad J. Făcând acest lucru, am reușit să păstrăm 81 din cele 551 de site-uri pentru analize experimentale ulterioare (470 de site-uri prezise s-au dovedit a fi false din cauza erorilor de cartografiere la capăt) Analizele de secvențiere bazate pe PCR și Sanger la aceste 81 de situri reținute ne-au permis să eliminăm încă 38 de site-uri, care au fost confirmate nepolimorice între C57BL / 6J și C57BL / 6N din cauza erorilor de referință. În cele din urmă, toate cele 43 de variante prezise au fost validate ca SV autentice care diferențiază tulpinile C57BL / 6J și C57BL / 6N (Tabelul 2), rezultând o rată fals fals pozitivă.

Din cele 43 SV, 15 se suprapun cu o genă (Tabelul 2), inclusiv 12 variante care se află în regiuni necodificatoare ale genelor, 2 variante care afectează regiunea codificatoare a genei (Vmn2r65 (Vomeronasal 2, receptor 65) și Nnt (nucleotidă nicotinamidă transhidrogenază)) și 1 care afectează întreaga genă Cyp2a22 (citocromul P450, familia 2, subfamilia a, polipeptida 22). Doar 1 din cele 15 variante este cunoscută și a fost deja asociată cu un fenotip, Nnt; restul de 14 sunt noi și pentru mai mulți discutăm potențialele funcții biologice ale acestora mai jos.

Folosind șobolanul ca specie de grup, am dedus apoi originea celor 43 SV între C57BL / 6J și C57BL / 6N, și a constatat că 27 de variante au fost produsul retrotranspoziției, 15 au fost SV care nu au fost mediate de repetare și 1 a fost o repetare în tandem cu număr variabil (VNTR) (Tabelul 2). În mod remarcabil, aproape toate variantele erau private fie pentru C57BL / 6J, fie pentru C57BL / 6N (Tabelul 2).

Evaluarea fenotipică cuprinzătoare a șoarecilor C57BL / 6N și C57BL / 6J

În paralel cu analize genomice, consorțiul European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) a efectuat o comparație fenotipică cuprinzătoare a tulpinilor C57BL / 6NTac și C57BL / 6J. EUMODIC cuprinde patru centre de șoareci care realizează fenotipare primară pe bază largă a 500 de linii knock-out mutante de șoarece generate de proiectele europene de condiționare a mutagenezei șoarecilor (EUCOMM) și Knockout Mouse (KOMP) din cadrul programului IKMC. Cohorte de șoareci din fiecare linie mutantă intră în resursa europeană de fenotipare a șoarecilor de evaluare a fenotipului slim (EMPReSSslim), care constă din două conducte de fenotipare, care cuprind 20 de platforme de fenotipare (identificate printr-un număr ESLIM__procedure_number) care se desfășoară de la 9 la 15 săptămâni (a se vedea fișierul suplimentar 2, Figura S1). Metodele pentru efectuarea fiecărui ecran sunt detaliate în procedurile standard de operare (SOP) care pot fi găsite în baza de date EMPReSS. Datele au fost achiziționate cu privire la 413 parametri fenotip împreună cu 146 parametri de metadate și au fost introduse în baza de date EuroPhenome. Ca parte a acestei lucrări, am capturat date de control extinse asupra fenotipului de bază al C57BL / 6NTac. De asemenea, am profitat de această ocazie pentru a investiga fenotipul șoarecilor C57BL / 6J și pentru a compara acest lucru cu C57BL / 6NTac (denumit în continuare J și respectiv N).

Pentru fiecare linie, N și J, vârsta -soareci similari au fost analizați prin ambele conducte EMPReSSslim. Datele au fost achiziționate de la toate cele patru centre din consorțiu pentru 19 din cele 20 de platforme din conductă, cu excepția analizelor de sortare a celulelor activate cu fluorescență (FACS) (a se vedea fișierul suplimentar 2, Figura S1). Protocoalele EMPReSSslim au fost riguros standardizate în consorțiul EUMODIC; cu toate acestea, rămân unele diferențe, de exemplu, în echipamente și dietă, iar acest lucru este surprins în seturile de metadate din cadrul EuroPhenome. Desigur, vor exista și alte diferențe de mediu nerecunoscute între centre. În mod colectiv, acestea pot contribui la diferențele genei-mediu și la rezultatul fenotipului, dar nu am căutat să definim în mod sistematic aceste efecte, concentrându-ne în schimb pe fenotipurile care sunt concordante între centre și sunt în mod clar robuste la perturbațiile de mediu nerecunoscute. Datele din cohortele N și J din fiecare centru au fost depuse în EuroPhenome și au fost supuse unei analize statistice pentru fiecare centru (a se vedea Materiale și metode). Este important de menționat aici că comparațiile dintre N și J au fost efectuate în interior, nu între centre. Analiza statistică a rezultatelor între centre nu a fost efectuată, deoarece experimentele nu au putut fi controlate complet între centre din cauza variabilelor de mediu și de altă natură și a diferențelor în numărul de animale analizate în fiecare centru (a se vedea fișierul suplimentar 3, Figura S2a-d). Am ales astfel să adoptăm o abordare care s-a concentrat pe comparațiile tulpinilor în cadrul centrelor individuale, spre deosebire de generarea unui model statistic multicentric care a examinat o diferență statistică generală între cele două tulpini. Cu toate acestea, replicarea comparației N și J între mai mulți centri ne-a oferit o putere suplimentară în fundamentarea diferențelor fenotipice semnificative între cele două tulpini. În plus față de analiza N și J prin conducta de fenotipare primară EMPReSSslim la cele patru centre, alți parteneri din cadrul consorțiului EUMODIC au aplicat o gamă mai largă de teste de fenotipare adesea mai sofisticate pentru a aduna informații suplimentare, dintre care unele explorează în continuare și își propune să fundamentează diferențele fenotipice relevate prin EMPReSSslim.

În analiza datelor, ne-am concentrat mai întâi pe identificarea parametrilor fenotipului care au arătat o diferență consistentă și semnificativă între N și J în trei sau mai multe centre.Am identificat 27 de parametri de fenotip în această clasă (Figura 1a; vezi fișierul suplimentar 3, Figura S2a, e). În mai multe cazuri, aceste diferențe au fost susținute de date din analiza secundară și vom discuta aceste instanțe mai jos. De asemenea, am descoperit o a doua clasă de parametri pentru care s-au observat tendințe similare în două centre, dar nu s-au văzut tendințe în celelalte două centre (Figura 1b; vezi fișierul suplimentar 3, Figura S2b, f). Cu toate acestea, analiza noastră statistică (a se vedea Materiale și metode) indică faptul că pentru această clasă de parametri semnificația generală a diferențelor N versus J este scăzută, iar tendințele observate ar trebui tratate cu prudență. Cu toate acestea, în mai multe dintre aceste cazuri, tendințele observate sunt în concordanță cu fenotipurile găsite în prima clasă de parametri. De asemenea, am identificat o a treia, dar mică clasă de parametri, care au arătat diferențe foarte semnificative în două sau mai multe centre (Figura 2; vezi fișierul suplimentar 3, Figura S2d, h), dar în mod neașteptat, tendința opusă într-unul dintre centre. Discutăm motivele acestor anomalii, care, în unele cazuri, probabil apar din interacțiunile genei-centru. Clasa finală reprezintă un număr mare de teste în care nu am observat diferențe consistente și semnificative între centre, concluzionând că acestea sunt mai probabil să fie fals pozitive, mai degrabă decât dovezi pentru diferențele N / J (vezi fișierul suplimentar 3, Figura S2c , g).

Dismorfologie și oftalmologie

Nu am găsit dovezi pentru diferențe majore în caracteristicile morfologice dintre N și J, inclusiv analiza cu raze X a scheletului. Cu toate acestea, au fost identificate o serie de diferențe oftalmologice între cele două tulpini. Analiza funcțiilor vizuale generale utilizând tamburul optokinetic virtual a constatat o vedere redusă la N comparativ cu șoarecii J (N: 0,314 ciclu / grad, 95% CI 0,305 până la 0,323, n = 89; J: 0,399 cicluri / grad, 95% CI 0,394 până la 0.404, n = 128; p < 0.001, testul t Student). Acest lucru nu a reflectat diferențele în opacitățile obiectivului, deoarece analiza cantitativă folosind o cameră Scheimpflug a găsit lentile transparente în ambele tulpini (N: 5,2 + 0,5%, n = 10; J: 5,0% + 0,5% opacitate, n = 10). Pete albe au fost observate în fundul de șoareci N la o frecvență ridicată, care au fost absente la șoareci J ( Figura 3A). Acest lucru se datorează probabil prezenței mutației Crb1rd8 la șoareci N, așa cum sa raportat anterior, deși în cazul nostru petele au fost observate numai în retina ventrală, cu variații ale dimensiunii petelor și a zonei afectate între șoareci (Figura 3A) Studiile ulterioare utilizând endoscopia topică a fundului au arătat că numărul vaselor principale a fost variabil, variind între trei și șapte pentru vene și trei și eig ht pentru artere (Figura 3B), iar un șoarece dat ar putea avea numere care nu se potrivesc între cei doi ochi. Numărul mediu atât al venelor, cât și al arterelor a fost semnificativ mai mare (P < 0.001) la J decât la șoarecii N (Figura 3C).

Cardiovascular

Măsurătorile neinvazive ale tensiunii arteriale (ESLIM_002) au arătat că presiunea arterială sistolică a fost semnificativ mai mare la J decât la șoarecii N, deși s-a constatat că semnificația efectului este variabilă între sexe și între centre. Mai mult, toți centrii au observat că rata pulsului a fost semnificativ mai mare la N decât la șoareci J.Cu toate acestea, un partener secundar din cadrul consorțiului a constatat că frecvența cardiacă sub anestezic a fost semnificativ mai mică la N decât la șoarecii masculi J, reflectată într-un interval lung de timp (RR) și QTc. De asemenea, am constatat că greutatea inimii normalizată la lungimea tibiei (ESLIM_020) a fost semnificativ mai mică la N decât la șoarecii J din două dintre centre și aceste rezultate au fost confirmate independent de analiza secundară. Studiile ulterioare ale structurii și funcției cardiace prin ecocardiografie și ale funcției contractile cardiace prin hemodinamică nu au reușit să evidențieze diferențe între N și J (date neprezentate).

Metabolism

Pentru măsurători de calorimetrie indirectă de șoareci hrăniți liber (ESLIM_003), am găsit o diferență consistentă între N și J pentru consumul de O2, producția de CO2 și producția de căldură. Șoarecii J au prezentat un schimb redus de gaze și o cheltuială de energie mai mică (producția de căldură sau rata metabolică) în comparație cu N, care a fost în general mai marcată la femei. În fenotiparea secundară cu calorimetrie indirectă postită, a existat o tendință către o cheltuială de energie mai mică în J versus N în timpul nopții. Acest lucru a fost posibil asociat cu scăderea activității ambulatorii în J și cu un consum mai mic de alimente în J comparativ cu N în timpul nopții, în special la re-hrănire (datele nu sunt prezentate). Nu a existat nicio diferență consistentă în activitate în ecranul de calorimetrie alimentat liber (ESLIM_003) în cele două centre în care a fost măsurată activitatea (vezi fișierul suplimentar 3, Figura S2c, g). Testele simplificate de toleranță la glucoză intraperitoneală (IPGTTs) (ESLIM_004) au arătat o toleranță redusă la glucoză la șoareci J versus N. Aceste observații asupra metabolismului glucozei sunt în concordanță cu ștergerea cunoscută a genei Nnt specifice șoarecilor J, care s-a dovedit că joacă un rol în reglarea răspunsului la insulină în celulele beta pancreatice.

Energie duală X -compozitia corpului absorptiometria razelor (DEXA) si masuratorile densitometriei osoase (ESLIM_005) au aratat ca N soareci au crescut masa de grasime (atat absoluta cat si normalizata la greutate). Mai mult decât atât, măsurătorile DEXA au indicat faptul că șoarecii J au crescut masa slabă comparativ cu N. În două dintre centre, măsurătorile densității minerale osoase au fost mai mari la șoarecii J masculi; cu toate acestea, această constatare nu a fost reprodusă în al treilea centru care a realizat ecrane DEXA. Am procedat la analiza tomografiei micro-computerizate (μCT) a celor două tulpini (Figura 4) și am constatat că grosimea corticală, porozitatea corticală și volumul osos trabecular au fost neschimbate între N și J. În plus, analiza diverselor micro-arhitecturi parametrii au indicat faptul că rețeaua trabeculară generală a fost similară. În cele din urmă, măsurarea formării osoase și a markerilor de resorbție nu a reușit să evidențieze diferențele dintre cele două tulpini (Figura 4).

Neurologic, comportamental și senzorial

Două centre au prezentat diferențe majore și consistente între N și J în activitatea în câmp deschis (ESLIM_007) (Figura 2), incluzând activitate mai mare la șoareci J măsurată prin distanța parcursă și un număr mai mare de intrări centrale, indicativ al anxietății reduse. Aceste diferențe sunt în concordanță cu datele raportate recent privind o comparație comportamentală a N și J. Interesant este că efectele cele mai semnificative s-au limitat la bărbații din cele două centre. În mod neașteptat, într-un al treilea centru, s-a văzut reversul, N șoareci fiind mai activi decât J, deși aceste efecte au fost observate atât la bărbați, cât și la femei. Un al patrulea centru nu a detectat aceste efecte, fără a găsi diferențe semnificative. Toate centrele au folosit SOP EMPReSSslim pentru procedură, care a inclus o cerință pentru arene de dimensiuni similare, dar au existat unele diferențe operaționale între centre, inclusiv utilizarea de camere simple sau multiple pentru adăpostirea arenelor; arene transparente sau opace; și absența sau prezența îmbogățirii mediului în cuștile casnice (despre care se știe că are un efect asupra rezultatelor comportamentale). Cu toate acestea, niciuna dintre aceste variabile nu a fost în concordanță cu observațiile diferite între centre.Cu toate acestea, nu putem exclude influențele microbiomului intestinal, care ar putea fi de așteptat să difere între centre. Se știe că microbiomul intestinal influențează funcția și comportamentul sistemului nervos central, în principal prin axa hipotalamo-hipofizo-suprarenală. Concluzionăm că, în anumite condiții, pot fi observate diferențe semnificative în parametrii în câmp deschis între N și J, dar natura acestor diferențe este sensibilă la condițiile de mediu necunoscute. Este interesant faptul că constatarea contradictorie majoră în fenotipurile N versus J s-a limitat la o platformă de fenotipare comportamentală. În schimb, pentru majoritatea celorlalte teste (în afară de câțiva parametri de chimie hematologică și clinică, vezi mai jos), nu am găsit inconsecvențe, indicând faptul că, spre deosebire de majoritatea platformelor de fenotipare, analizele comportamentale pot fi extrem de sensibile la parametrii de mediu.

De asemenea, am efectuat un test de tranziție lumină / întuneric pentru a compara anxietatea la tulpinile N și J (Figura 5). Nu am găsit diferențe semnificative între șoareci N și J în numărul de tranziții lumină-întuneric sau în timpul procentual petrecut în compartimentul întunecat. Cu toate acestea, latența de a intra în compartimentul întunecat a fost semnificativ mai mare la șoareci N. Testarea SHIRPA modificată (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phenotype Assessment) (ESLIM_008, Figura 1a) în toate cele patru centre a indicat faptul că șoarecii masculi J au crescut semnificativ activitatea locomotorie, ceea ce s-a corelat cu rezultatele creșterii distanței parcurse în testarea în câmp deschis în unele centre (a se vedea mai sus).

Am efectuat o serie de teste care reflectă capacitatea motorie. Diferențele de rezistență la prindere (ESLIM_009) au fost observate în toate centrele cu J fiind mai mare decât N, dar parametrii afectați au fost diferiți, unele centre raportând diferențe în rezistența la prindere a membrelor anterioare și unele pentru rezistența la prindere a membrelor anterioare și posterioare combinate (Figura 1a , b). Testarea Rotarod (ESLIM_010) a arătat diferențe semnificative în latența de a scădea în toate centrele, deși capacitatea motorie redusă de N a fost observată doar la femei în două dintre centre. Am explorat în continuare abilitățile motorii la șoarecii masculi N și J examinând performanțele de învățare motorie pe rotarod pe parcursul a 4 zile (Figura 5). În timp ce performanța motorie a șoarecilor J s-a îmbunătățit semnificativ din ziua 1 până în ziua 2, performanța șoarecilor N s-a îmbunătățit doar treptat și a fost semnificativ diferită de măsurătorile din ziua 1 numai din ziua 3 (P < 0,05) în continuare. Mai mult, din ziua 2 până în ziua 4 au existat diferențe foarte semnificative în latența de a se încadra între N și J. Testarea primară efectuată la centre a descoperit astfel o potențială performanță motorie redusă în N care a fost confirmată și elaborată în continuare prin teste mai sofisticate de performanță a învățării motorii.

De asemenea, am efectuat două teste comportamentale suplimentare pentru a elabora în continuare diferențele N versus J. În primul rând, am comparat performanța N și J în testul labirint de apă Morris utilizat pentru a evalua memoria spațială. N șoareci masculi au prezentat performanțe foarte reduse semnificativ (latență mai mare) în comparație cu șoareci masculi J (Figura 6). În al doilea rând, am examinat învățarea emoțională sau memoria pentru un eveniment aversiv folosind testele de repere și condiționarea fricii; totuși, aici nu am găsit diferențe semnificative între cele două tulpini (date neprezentate).

Explorarea tresăririi acustice și inhibarea pre-pulsului (ESLIM_011) (Figura 1a) în cele două tulpini au identificat o varietate de parametri care au fost semnificativ și consecvent diferite între centre. Magnitudinea acustică a tresăririi la 110 dB și magnitudinea răspunsului la tresărire la pre-puls și puls (PP1-PP4 + puls, vezi EMPReSSslim) au fost reduse în N comparativ cu J, deși acest efect nu a fost observat la femei într-un centru. În concordanță cu aceste observații, am constatat că inhibiția pre-puls a diferit între N și J, cu inhibarea pre-puls la PP2 și PP3 și inhibarea globală a crescut în N comparativ cu J. Mai mulți alți parametri de magnitudine și de inhibare a pre-pulsului au arătat efecte semnificative în unul sau două centre (Figura 1b; vezi fișierul suplimentar 3, Figura S2b, f), dar nu au fost observate diferențe în alte centre. Observațiile privind magnitudinea tresăririi nu au fost confundate de diferențele auditive, deoarece am evaluat pragurile auditive atât la șoarecii J, cât și la cei de la N folosind testul de răspuns al trunchiului cerebral auditiv și nu am găsit diferențe (datele nu sunt prezentate).

Chimie clinică

Au fost efectuate panouri extinse de teste de chimie clinică pe probe de plasmă colectate la sfârșitul fiecărei conducte de fenotipare. Eșantionul de sânge de la sfârșitul conductei 1 (ESLIM_021) a fost colectat după un post peste noapte, în timp ce eșantionul de la sfârșitul conductei 2 (ESLIM_015) a fost de la un animal hrănit liber.Datele care au fost de acord cu cel puțin trei centre au arătat că ureea și electroliții de sodiu, potasiu și clorură au fost semnificativ mai mari în plasmă de la șoareci J față de șoareci N (Figura 1a), deși au existat unele interacțiuni clare sex-centru. Datele privind nivelurile de glucoză plasmatică hrănite liber și post au indicat faptul că pentru fiecare test, cel puțin două centre au constatat că nivelurile de glucoză plasmatică sunt mai mari la N decât la șoareci J (Figura 1b). Cu toate acestea, nivelurile de glucoză din sânge sunt cunoscute a fi afectate de manipularea animalelor, prelucrarea probelor și utilizarea anestezicelor. Datele prezentate aici provin din probe colectate sub anestezic izofluoran gazos, în afară de un centru în care probele au fost colectate sub injecție cu ketamină / xilazină (vezi Figura 1). Așa cum s-a discutat mai sus, din cauza afectării lor cunoscute în secreția de insulină, pare contradictoriu pentru șoarecii J să aibă niveluri mai scăzute de glucoză plasmatică decât șoarecii N, dar ștergerea din Nnt pare să afecteze doar ratele de eliminare a glucozei și șoarecii J cu repaus alimentar sau fără provocare nu au hiperglicemie constantă. Mai mulți alți parametri s-au dovedit a fi mai mari la J decât la șoareci N în cel puțin două centre, dar în fiecare caz celălalt centru nu a raportat diferențe semnificative în aceiași parametri (Figura 1b), de exemplu, acizi grași liberi. Două centre au constatat că fierul a fost semnificativ mai mare la N masculi și că fosfataza alcalină a fost semnificativ mai mare la J masculi. Unul dintre acești centri a constatat că același lucru este valabil și la femei (Figura 2). Cu toate acestea, datele pentru fiecare dintre acești parametri dintr-un al treilea centru contrazic aceste constatări.

Hematologie

Au fost măsurați diferiți parametri hematologici la sfârșitul Pipeline 2 (ESLIM_016). Modificări semnificative ale unui număr de parametri au fost găsite de către doi centre, dar aceste rezultate nu au fost reproduse în celelalte, inclusiv numărul de globule albe și roșii, volumul mediu de celule și hemoglobina corpusculară medie (Figura 1b). Rezultatele contradictorii au fost obținute pentru testele de concentrație a hemoglobinei și a hematocritului (Figura 2). În fiecare caz, datele de la două centre au fost de acord, în timp ce un al treilea centru a arătat efectul opus. Acest lucru s-ar putea datora diferitelor tehnologii de mașini utilizate pentru măsurători hematologice în clinicile participante, așa cum sunt înregistrate în metadate.

Funcția imunitară și alergia

Am investigat o serie de fenotipuri secundare inclusiv rezistența gazdei la Listeria monocytogenes în tulpinile J și N. Femelele ambelor tulpini au fost mai susceptibile la infecția cu L. monocytogenes; cu toate acestea, diferența de sex în sensibilitatea gazdei Listeria a fost mai puțin pronunțată la N decât la J. Masculii din tulpina N au prezentat un clearance crescut al Listeriei în ziua 4 post-infecție, comparativ cu masculii J. Acest lucru se corelează cu un răspuns proinflamator crescut la bărbații N în ziua 3 după infecție, comparativ cu bărbații J (Figura 7).

De asemenea, am testat șoareci N și J pentru hipersensibilitate de contact indusă de dinitrofluorobenzen (DNFB) (CHS). S-au identificat diferențe semnificative în răspunsul la CHS între cele două tulpini de șoareci, J arătând un răspuns la CHS crescut. În mod vizibil, șoarecii femele din ambele tulpini au prezentat o CHS crescută în comparație cu șoarecii masculi. Investigarea capacității de reacție a celulelor ucigașe naturale (NK) la diferiți stimuli a arătat că o fracțiune mai mare a celulelor NK sunt activate de interleukină (IL) -12 singure sau în combinație cu IL-2 în J comparativ cu șoareci N; din nou, acest răspuns a fost mai semnificativ la femei (Figura 8).