La voie p53: boucles de rétroaction positive et négative

Diverses études dans la littérature ont identifié 10 boucles de rétroaction positives ou négatives dans la voie p53 (voir les figures 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10). Chacune de ces boucles crée un circuit composé de protéines dont les activités ou les taux de synthèse sont influencés par l’activation de p53, ce qui entraîne à son tour l’altération de l’activité de p53 dans une cellule. Parmi celles-ci, sept sont des boucles de rétroaction négative qui modulent l’activité p53 vers le bas (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cycline G, Wip-1 et Siah-1) et trois sont des boucles de rétroaction positive (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF et Rb) qui modulent l’activité de p53. Tous ces réseaux ou circuits sont autorégulateurs en ce qu’ils sont soit induits par l’activité p53 au niveau transcriptionnel, réprimés transcriptionnellement par p53 (p14 / 19 ARF, figure 3) ou sont régulés par les protéines induites par p53. Six de ces boucles de rétroaction agissent via MDM-2 (MDM-2, cycline G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT et Rb) pour moduler l’activité de p53.

Une découverte intéressante est que la voie p53 est intimement liée à d’autres transductions de signaux voies qui jouent un rôle important dans les origines du cancer. L’une des premières connexions étudiées concerne p14 / p19ARF et MDM-2. La protéine ARF p14 / 19 se lie à la protéine MDM-2 et module son activité ubiquitine ligase, augmentant les niveaux de la protéine p53 (Honda et Yasuda, 1999) (figure 3). La transcription du gène ARF p14 / 19 est régulée positivement par E2F-1 (Zhu et al., 1999) et la bêta-caténine (Damalas et al., 2001) et négativement régulée par p53 elle-même. De plus, les niveaux de protéine ARF p14 / 19 sont augmentés par les activités Ras et Myc dans une cellule (figure 3). La complexité de la régulation de p53 par p14 / p19 ARF a été récemment revue (Lowe et Sherr, 2003). Les complexes p14 / 19 ARF-MDM-2 sont souvent localisés dans le nucléole de la cellule en raison des signaux de localisation nucléolaire présents dans l’ARF p14 / p19. Le nucléole est le site de la biogenèse ribosomale et l’activité ARF p14 / 19 elle-même peut modifier le taux de traitement de l’ARN du précurseur de l’ARN ribosomique en sous-unités ribosomales matures (Sugimoto et al., 2003). Ainsi, l’ARF p14 / 19 en contrôlant les niveaux de MDM-2 et p53 et en les coordonnant avec la biogenèse ribosomale joue un rôle important dans la régulation du cycle cellulaire. Ceci a été récemment renforcé par la démonstration que la protéine ARF p14 / 19 peut également réguler l’activité Myc (et donc la taille des cellules) (Datta et al., 2004). Le MDM-2 dans le nucléole n’est cependant pas une entité passive. Il a été démontré que la protéine MDM-2 se lie spécifiquement à trois grandes sous-unités ribosomales protéines L5, L11 et L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), et la liaison de L5 (Dai et Lu, 2004) ou L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) à MDM-2 abaisse son activité ubiquitine ligase. De plus, le domaine annulaire de MDM-2 se lie spécifiquement à une séquence d’ARN trouvée dans la grande sous-unité d’ARN ribosomique (Elenbaas et al., 1996). Alors que toutes ces observations pointent vers un rôle central pour MDM-2 et p14 / 19 ARF dans la régulation de la biogenèse des ribosomes et du cycle cellulaire, nous ne comprenons pas comment ces observations se réunissent pour former cette boucle de régulation.

La protéine Rb peut être trouvée dans des cellules dans un complexe avec MDM-2 et p53, résultant en une activité p53 élevée et une activité apoptotique améliorée (Xiao et al., 1995). Des niveaux élevés d’E2F-1 actif non liés à Rb font basculer la réponse p53 de l’arrêt G-1 à l’apoptose. Rb et MDM-2 sont tous deux phosphorylés et inhibés par la cycline E-cdk2 (figure 4). Lorsque p53 est activé, il stimule la synthèse de la protéine p21, qui inhibe l’activité de la cycline E-cdk2, et ceci à son tour agit sur le complexe Rb-MDM-2 qui favorise l’activité de p53 et l’apoptose. Après des dommages à l’ADN, la protéine MDM-2 et la protéine p53 sont modifiées par la protéine kinase ATM (figure 4). Cela augmente l’activité de p53 de la même manière que le complexe p53-MDM-2-Rb augmente la fonction de p53 et est pro-apoptotique. Pour une revue détaillée récente de l’axe p53-Rb-E2F1, voir Yamasaki (2003).

Une partie de l’activation de la protéine p53 implique la phosphorylation de la protéine p53 au niveau des sérines situées aux résidus 33 et 46 par la p38 MAP kinase (figure 5). Cette MAP kinase p38 est elle-même activée par phosphorylation (régulée par la voie Ras-Raf-Mek-Erk) qui peut être inversée ou inactivée par la phosphatase Wip-1. Wip-1 est un gène sensible à p53 ou régulé par p53 formant une boucle d’autorégulation négative et reliant les voies p53 et Ras (Takekawa et al., 2000) (figure 5). Une protéine p53 activée régule positivement la transcription de l’ubiquitine ligase Siah-1 (Fiucci et al., 2004), qui à son tour agit pour dégrader la protéine bêta-caténine (Iwai et al., 2004) (Figure 6). Les niveaux de bêta-caténine peuvent réguler le gène ARF p14 / 19, qui à son tour régule négativement MDM-2 et entraîne des niveaux de p53 plus élevés (une boucle de rétroaction positive) (figure 6). Siah-1 relie ainsi la voie Wnt-beta-caténine-APC à la voie p53. Dans certains types de cellules, la protéine p53 induit la transcription du gène PTEN (figure 7). La protéine PTEN est une phosphatase PIP-3. La PIP-3 active la kinase AKT, qui possède un certain nombre de substrats protéiques anti-apoptotiques, y compris la protéine MDM-2. La phosphorylation entraîne la translocation de MDM-2 dans le noyau où elle inactive p53 (figure 7). Cela relie la voie p53 à la voie IGF-1-AKT et forme une boucle de rétroaction positive pour une activité p53 améliorée et une activité AKT réduite. Cette boucle dans la régulation p53 a également été récemment revue (Gottlieb et al., 2002). Ces boucles de rétroaction positive et négative accomplissent deux choses: (1) elles modulent l’activité de p53 dans la cellule et (2) elles coordonnent l’activité de p53 avec d’autres voies de transduction du signal qui régulent l’entrée de la cellule dans le cycle cellulaire (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenin, IGF-1 et cycline E-cdk2).

Il y a deux circuits d’autorégulation p53 supplémentaires qui réagissent négativement sur la fonction de p53. L’un des gènes les plus actifs qui répondent à p53 est le gène de la cycline G. Il est rapidement transcrit à des niveaux élevés après l’activation de p53 dans une grande variété de types cellulaires (Okamoto et Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). La protéine cycline G forme un complexe avec la PP2A phosphatase, qui élimine un résidu phosphate de MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (Figure 8), qui est ajouté à la protéine MDM-2 par une cdk kinase (Zhang et Prives, 2001) (Figure 4). La phosphorylation de MDM-2 par la cycline A / cdk2 inhibe son activité, ainsi la cycline G-PP2A phosphatase augmente l’activité de MDM-2 et inhibe p53. Les souris avec le gène de la cycline G assommé sont viables (Kimura et al., 2001), et les fibroblastes d’embryons de souris nulles cycline G ont des niveaux élevés de protéine p53 en l’absence de stress (Okamoto et al., 2002), démontrant que cette boucle de rétroaction est opérationnel in vivo et agit sur les niveaux basaux de p53 dans une cellule non seulement sur les niveaux plus élevés activés par p53 après un stress. La deuxième boucle de rétroaction négative implique un membre de la famille p53 de facteurs de transcription, qui comprennent p53, p63 et p73 qui sont liés par leur structure et leur fonction et qui ont évolué à partir d’un précurseur commun. Après une réponse au stress, le gène p53 est activé, qui à son tour stimule la transcription d’un ARN m épissé particulier du gène p73, appelé p73 delta N (figure 9). Cela traduit une protéine p73 sans son domaine amino-terminal. Les trois protéines de la famille p53 ont des structures de domaine similaires composées d’un domaine d’activation transcriptionnel N-terminal lié à un domaine central central qui se lie à une séquence d’ADN spécifique décrite ci-dessus. Les trois facteurs de transcription de la famille p53 reconnaissent la même séquence d’ADN, même si p53, p63 et p73 sont capables d’initier des programmes transcriptionnels distincts. Il existe, cependant, un grand nombre de gènes communs qui peuvent être régulés par les trois protéines comme récemment examiné dans Harms et al. (2004).Ainsi, lorsque p53 active la transcription de p73 delta N, la protéine p73 delta N peut se lier à de nombreux gènes régulés par p53, mais l’absence de domaine de transactivation la fait agir comme un répresseur ou un compétiteur de l’activation transcriptionnelle de p53. De cette manière, une boucle de rétroaction négative est mise en place et l’activité de p53 diminue (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (Figure 9). Ainsi, cinq de ces circuits de rétroaction positive ou négative (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) impliquent des gènes et des protéines qui sont des membres centraux d’autres voies de transduction du signal, tandis que deux (cycline G et p73 delta N) forment des boucles de rétroaction négatives directes.

Les dernières boucles de rétroaction négatives à discuter se présentent sous la forme d’ubiquitine ligases. De manière surprenante, il semble y avoir trois activités différentes de p53-ubiqutin ligase (MDM-2, Cop-1 et Pirh-1), chacune formant une boucle autorégulatrice entraînant une activité p53 plus faible (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (Figure 10). Chaque gène est activé par la transcription p53. On ne sait pas exactement pourquoi il y a ce niveau de redondance. Plusieurs possibilités sont que ces produits géniques soient exprimés ou agissent de manière optimale dans différents types de cellules ou de tissus ou même à différents stades de développement. Par exemple, la souris knock-out MDM-2 est mortelle environ 6 jours après la fécondation juste au moment de l’implantation du blastocyste. Cela peut être déclenché par l’hypoxie qui doit survenir à ce stade, activant p53 en l’absence de MDM-2 et provoquant l’apoptose. En accord avec cette interprétation est l’observation qu’une souris double knockout p53, MDM-2 est viable et naît normalement comme une souris knockout p53 (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Ceci est donc cohérent avec l’idée que la protéine MDM-2 agit sans activité de sauvegarde de l’ubiquitine ligase au stade blastocyste, mais ces autres protéines pourraient permettre une fonction plus normale aux stades ultérieurs du développement. Ces idées sont désormais testables. Il est également possible qu’une ou plusieurs de ces trois ubiquitine ligases soient impliquées dans le maintien des niveaux de p53 à l’état non stressé ou basal, tandis que d’autres n’agissent qu’après la production d’une p53 induite par le stress. Les protéines p53 activées et les protéines p53 induites par le stress ont des modifications protéiques très différentes et l’impact de celles-ci sur l’activité de MDM-2, Cop-1 ou Pirh-2 n’est actuellement pas clair. Il semble probable que chacune de ces trois ubiquitine ligases forme des complexes protéiques dans la cellule et les protéines associées peuvent bien différer pour chacune de ces ligases, les reliant à différents circuits de régulation. À l’heure actuelle, on en sait beaucoup sur le MDM-2 et relativement peu d’attention a été accordée au rôle de Cop-1 et Pirh-2, qui n’ont été rapportés dans la littérature que depuis environ un an. De plus, il a été démontré très récemment que la p53 était le substrat d’encore une autre enzyme ubiquitine ligase E3, les topors (Rajendra et al., 2004). Il reste à déterminer si les topors sont également une cible transcriptionnelle de p53, et devraient donc être ajoutés à la liste croissante des protéines contribuant au contrôle autorégulateur de la voie p53. Les prochaines années d’étude devraient aborder ces questions.

Comme mentionné ci-dessus, de nombreuses boucles de régulation impliquent le MDM-2, soulignant ainsi le rôle central du MDM-2 dans le contrôle de l’activité de p53. Une analyse génétique des mutations p53 et MDM-2 qui bloquent ce complexe protéique a identifié des résidus d’acides aminés critiques dans chaque protéine qui sont importants pour cette interaction de liaison (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Il a été démontré que ces mêmes résidus d’acides aminés établissent ces contacts protéiques dans la structure cristalline de l’extrémité amino-terminale de HDM-2 (la protéine humaine) et d’un peptide de l’extrémité amino-terminale de p53 (Kussie et al., 1996) . Les résidus phényalanine 19, tryptophane 23 et leucine 26 de p53 forment les contacts majeurs dans la poche hydrophobe MDM-2. La phosphorylation des résidus sérine 20 et éventuellement sérine 15 devrait affaiblir ces contacts, et les peptides et médicaments qui entrent en compétition avec ces contacts bloquent le complexe p53 MDM-2 et favorisent l’apoptose dans les cellules (Klein et Vassilev, 2004). Ainsi, le complexe p53-MDM-2 et l’activité ubiquitine ligase MDM-2 sont devenus une cible médicamenteuse majeure pour certains cancers. Dans environ un tiers des sarcomes humains et dans certaines leucémies et glioblastomes, le gène HDM-2 a été amplifié et cette protéine est surexprimée. Le gène p53 est de type sauvage et la protéine p53 est apparemment inactive, de sorte que les médicaments qui cassent le complexe p53-HDM-2 devraient activer p53. De plus, de nombreux autres cancers semblent exprimer le produit du gène HDM-2 à des niveaux élevés même lorsque le gène HDM-2 n’est pas amplifié. Dans ces types de cancers, le blocage de l’activité HDM-2 ou la libération de p53 de ce complexe pourrait bien induire une apoptose sélective dans les cellules cancéreuses. Cela pourrait également améliorer l’activité chimiothérapeutique de certains médicaments qui activent p53.

La boucle autorégulatrice p53-MDM-2 devrait mettre en place un oscillateur avec des niveaux p53 et MDM-2 augmentant et diminuant avec le temps et déphasés dans la cellule. Ceci a d’abord été démontré en mesurant les niveaux de MDM-2 et de p53 à l’aide de Western blots de protéines provenant de cellules en culture subissant une réponse au stress p53 (Lev Bar-Or et al., 2000). Alors que les oscillations sont observées et amorties avec le temps, cette expérience fait la moyenne des concentrations de protéines de nombreuses cellules en culture qui peuvent être déphasées dans leurs oscillations, donnant lieu à des interférences constructives ou destructives. Pour cette raison, les protéines de fusion p53 et HDM2 marquées par fluorescence ont été imagées dans des cellules individuelles pour suivre les changements dans les niveaux de p53 et HDM-2 dans les cellules subissant une réponse au stress p53. Les oscillations déphasées attendues ont été observées et, de manière surprenante, le nombre d’oscillations dans une cellule était proportionnel à la dose de rayonnement donnée à ces cellules (Lahav et al., 2004). Cela suggère que p53 peut mesurer l’intensité d’un signal de contrainte de manière numérique (nombre d’oscillations) et non de manière analogique (concentrations de p53 plus élevées). Des oscillations similaires ont été observées dans d’autres voies de transduction du signal qui ont des boucles autorégulatrices négatives telles que la voie NF-κ-B avec les protéines NF-κ-B et I-κ-B (Scott et al., 1993). Ces signaux numériques résultant d’oscillations dans la quantité de facteurs de transcription pourraient bien entraîner un modèle d’expression génique périodique. Cependant, la façon dont les signaux numériques au niveau du facteur de transcription sont traduits en signaux analogiques au niveau de la quantité d’ARNm produit par un gène reste incertaine. Ces expériences conduisent à la possibilité que différents nombres d’oscillations, la synchronisation ou la longueur d’onde des oscillations ou l’amplitude de ces oscillations puissent avoir un impact sur le modèle choisi d’expression génique et le résultat (arrêt du cycle cellulaire, apoptose ou sénescence) du p53 réponse.

Pourquoi y a-t-il autant de boucles de rétroaction dans le chemin p53? Il y a beaucoup de réponses à cette question. Tous les mécanismes peuvent ne pas être actifs dans le même type de cellule ou de tissu ou aux mêmes stades de développement. Les boucles de rétroaction du type décrit ici fournissent un moyen pour connecter la voie p53 avec d’autres voies de transduction de signal et coordonner les signaux cellulaires pour la croissance et la division. Les redondances dans un système peuvent parfois éviter les erreurs et un système de sauvegarde réduit le phénotype des mutations. D’autre part, toutes les boucles de rétroaction représentées sur les figures 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 ne peuvent pas résister à l’épreuve du temps et à d’autres expériences. Bon nombre de ces voies ont été élucidées par des expériences menées avec des cellules cancéreuses en culture qui présentent des mutations qui modifient ces voies. Même les cellules normales en culture ou les souris knock-out (en raison de l’accommodation à la mutation) peuvent ne pas refléter toutes les conditions qui se produisent dans les cellules et organes normaux in vivo. Il est particulièrement difficile de prouver qu’une protéine kinase ou phosphatase spécifique agit sur un substrat spécifique in vivo et a un résultat qui peut être mesuré quantitativement. Ainsi, nous devons continuer à tester et à remettre en question les fonctions et les voies qui, selon nous, opèrent dans une cellule. Cependant, ces constructions, présentées dans les figures 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10, sont utiles pour formuler des hypothèses et tester des idées qui conduiront sûrement à de nouvelles connaissances sur la nature des cancers et la conception de médicaments et agents qui tuent sélectivement les cellules cancéreuses.