A via de p53: loops de feedback positivo e negativo

Uma variedade de estudos na literatura identificou 10 laços de feedback positivo ou negativo na via de p53 (ver Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10). Cada um desses loops cria um circuito composto de proteínas cujas atividades ou taxas de síntese são influenciadas pela ativação do p53, e isso, por sua vez, resulta na alteração da atividade do p53 em uma célula. Destes, sete são loops de feedback negativo que modulam a atividade do p53 (MDM-2, Cop-1, Pirh-2, p73 delta N, cyclin G, Wip-1 e Siah-1) e três são loops de feedback positivo (PTEN- AKT, p14 / 19 ARF e Rb) que modulam a atividade de p53. Todas essas redes ou circuitos são autorregulatórios no sentido de que são induzidas pela atividade de p53 no nível transcricional, reprimidas transcricionalmente por p53 (p14 / 19 ARF, Figura 3) ou são reguladas por proteínas induzidas por p53. Seis desses loops de feedback atuam através de MDM-2 (MDM-2, ciclina G, Siah-1, p14 / 19 ARF, AKT e Rb) para modular a atividade de p53.

Uma descoberta interessante é que a via p53 está intimamente ligada a outra transdução de sinal vias que desempenham um papel significativo nas origens do câncer. Uma das primeiras conexões estudadas envolve p14 / p19ARF e MDM-2. A proteína ARF p14 / 19 se liga à proteína MDM-2 e modula sua atividade ubiquitina ligase, aumentando os níveis da proteína p53 (Honda e Yasuda, 1999) (Figura 3). A transcrição do gene ARF p14 / 19 é regulada positivamente por E2F-1 (Zhu et al., 1999) e beta-catenina (Damalas et al., 2001) e negativamente regulada pelo próprio p53. Além disso, os níveis da proteína ARF p14 / 19 são aumentados pelas atividades Ras e Myc em uma célula (Figura 3). A complexidade da regulação de p53 por p14 / p19 ARF foi revisada recentemente (Lowe e Sherr, 2003). Os complexos p14 / 19 ARF-MDM-2 são frequentemente localizados no nucléolo da célula devido aos sinais de localização nucleolar presentes no ARF p14 / p19. O nucléolo é o local da biogênese ribossômica e a própria atividade do ARF p14 / 19 pode alterar a taxa de processamento do RNA do precursor do RNA ribossômico em subunidades ribossômicas maduras (Sugimoto et al., 2003). Assim, p14 / 19 ARF, controlando os níveis de MDM-2 e p53 e coordenando isso com a biogênese ribossômica, desempenha um papel importante na regulação do ciclo celular. Isso foi recentemente reforçado pela demonstração de que a proteína ARF p14 / 19 também pode regular a atividade de Myc (e, portanto, o tamanho da célula) (Datta et al., 2004). O MDM-2 no nucléolo não é, entretanto, uma entidade passiva. Foi demonstrado que a proteína MDM-2 se liga especificamente a três grandes proteínas da subunidade ribossomal L5, L11 e L23 (Marechal et al., 1994; Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004 ), e a ligação de L5 (Dai e Lu, 2004) ou L11 (Lohrum et al., 2003; Zhang et al., 2003) ao MDM-2 diminui sua atividade de ubiquitina ligase. Além disso, o domínio do dedo anular do MDM-2 liga-se especificamente a uma sequência de RNA encontrada na grande subunidade do RNA ribossômico (Elenbaas et al., 1996). Embora todas essas observações apontem para um papel central para MDM-2 e ARF p14 / 19 na regulação da biogênese do ribossomo e do ciclo celular, não entendemos como essas observações se juntam para formar esse ciclo regulatório.

A proteína Rb pode ser encontrada em células em um complexo com MDM-2 e p53, resultando em alta atividade de p53 e aumento da atividade apoptótica (Xiao et al., 1995). Altos níveis de E2F-1 ativo não ligado a Rb muda a resposta de p53 de parada G-1 para apoptose. Tanto Rb quanto MDM-2 são fosforilados e inibidos pela ciclina E-cdk2 (Figura 4). Quando o p53 é ativado, ele estimula a síntese da proteína p21, que inibe a atividade da ciclina E-cdk2, que por sua vez atua sobre o complexo Rb-MDM-2 que promove a atividade do p53 e apoptose. Após o dano ao DNA, tanto a proteína MDM-2 quanto a proteína p53 são modificadas pela proteína quinase ATM (Figura 4). Isso aumenta a atividade do p53 da mesma forma que o complexo p53-MDM-2-Rb aumenta a função do p53 e é pró-apoptótico. Para uma revisão recente detalhada do eixo p53-Rb-E2F1, ver Yamasaki (2003).

Parte da ativação da proteína p53 envolve a fosforilação da proteína p53 em serinas localizadas nos resíduos 33 e 46 por a p38 MAP quinase (Figura 5). Esta quinase p38 MAP é ela própria ativada por fosforilação (regulada pela via Ras-Raf-Mek-Erk) que pode ser revertida ou inativada pela fosfatase Wip-1. Wip-1 é um gene responsivo a p53 ou regulado por p53 que forma uma alça autorregulatória negativa e conecta as vias de p53 e Ras (Takekawa et al., 2000) (Figura 5). Uma proteína p53 ativada regula positivamente a transcrição da ubiquitina ligase Siah-1 (Fiucci et al., 2004), que por sua vez atua para degradar a proteína beta-catenina (Iwai et al., 2004) (Figura 6). Os níveis de beta-catenina podem regular o gene p14 / 19 ARF, que por sua vez regula negativamente o MDM-2 e resulta em níveis mais elevados de p53 (um loop de feedback positivo) (Figura 6). Siah-1, portanto, conecta a via Wnt-beta-catenina-APC à via p53. Em alguns tipos de células, a proteína p53 induz a transcrição do gene PTEN (Figura 7). A proteína PTEN é uma PIP-3 fosfatase. O PIP-3 ativa a AKT quinase, que possui uma série de substratos proteicos antiapoptóticos, incluindo a proteína MDM-2. A fosforilação resulta na translocação de MDM-2 para o núcleo, onde inativa o p53 (Figura 7). Isso conecta a via do p53 com a via IGF-1-AKT e forma um loop de feedback positivo para aumentar a atividade de p53 e diminuir a atividade de AKT. Este loop na regulação do p53 também foi revisado recentemente (Gottlieb et al., 2002). Esses loops de feedback positivo e negativo realizam duas coisas: (1) eles modulam a atividade de p53 na célula e (2) eles coordenam a atividade de p53 com outras vias de transdução de sinal que regulam a entrada da célula no ciclo celular (Rb-E2F-1, myc, Ras, beta-catenina, IGF-1 e atividades de ciclina E-cdk2).

Existem dois circuitos autorregulatórios adicionais de p53 que retroalimentam negativamente a função de p53. Um dos genes responsivos ao p53 mais ativos é o gene da ciclina G. É rapidamente transcrito para níveis elevados após a ativação de p53 em uma ampla variedade de tipos de células (Okamoto e Beach, 1994; Zauberman et al., 1995; Bates et al., 1996; Yardley et al., 1998). A proteína ciclina G forma um complexo com a fosfatase PP2A, que remove um resíduo de fosfato de MDM-2 (Okamoto et al., 2002) (Figura 8), que é adicionado à proteína MDM-2 por uma cinase cdk (Zhang e Prives, 2001) (Figura 4). A fosforilação de MDM-2 pela ciclina A / cdk2 inibe sua atividade, portanto, a ciclina G-PP2A fosfatase aumenta a atividade de MDM-2 e inibe o p53. Camundongos com o gene da ciclina G desativado são viáveis (Kimura et al., 2001), e os fibroblastos de embrião de camundongo nulo da ciclina G têm níveis elevados de proteína p53 na ausência de estresse (Okamoto et al., 2002), demonstrando que este ciclo de feedback está operacional in vivo e atua sobre os níveis basais de p53 em uma célula, não apenas sobre os níveis mais elevados de p53 ativado após o estresse. O segundo ciclo de feedback negativo envolve um membro da família p53 de fatores de transcrição, que incluem p53, p63 e p73, que estão relacionados por estrutura e função e evoluíram de um precursor comum. Após uma resposta ao estresse, o gene p53 é ativado, o que por sua vez estimula a transcrição de um determinado m-RNA emendado do gene p73, denominado p73 delta N (Figura 9). Isso traduz uma proteína p73 sem seu domínio amino-terminal. Todos os três da família p53 de proteínas têm estruturas de domínio semelhantes compostas por um domínio de ativação transcricional N-terminal ligado a um domínio de núcleo central que se liga a uma sequência de DNA específica discutida acima. Todos os três fatores de transcrição da família p53 reconhecem a mesma sequência de DNA, embora p53, p63 e p73 sejam capazes de iniciar programas de transcrição distintos. Há, no entanto, um grande número de genes comuns que podem ser regulados por todas as três proteínas, conforme revisado recentemente em Harms et al. (2004).Assim, quando p53 ativa a transcrição de p73 delta N, a proteína p73 delta N pode se ligar a muitos dos genes regulados por p53, mas a ausência de um domínio de transativação faz com que ela atue como um repressor ou competidor da ativação transcricional de p53. Desta forma, um ciclo de feedback negativo é estabelecido e a atividade de p53 diminui (Grob et al., 2001; Kartasheva et al., 2002) (Figura 9). Assim, cinco desses circuitos de feedback positivo ou negativo (Rb, PTEN, Siah-1, Wip-1, p14 / 19 ARF) envolvem genes e proteínas que são membros centrais de outras vias de transdução de sinal, enquanto dois (ciclina G e p73 delta N) formam loops de feedback negativo direto.

Os loops de feedback negativo final a serem discutidos vêm na forma de ubiquitina ligases. Surpreendentemente, parece haver três atividades diferentes de p53-ubiqutin ligase (MDM-2, Cop-1 e Pirh-1), cada uma formando uma alça autorregulatória resultando em menor atividade de p53 (Leng et al., 2003; Dornan et al. ., 2004) (Figura 10). Cada gene é ativado transcricionalmente pelo p53. Por que existe esse nível de redundância não está claro no momento. Várias possibilidades são que esses produtos gênicos sejam expressos ou atuem de forma otimizada em diferentes tipos de células ou tecidos ou mesmo em diferentes estágios de desenvolvimento. Por exemplo, o camundongo knockout para MDM-2 é letal cerca de 6 dias após a fertilização, apenas na implantação do blastocisto. Isso pode ser desencadeado pela hipóxia que deve ocorrer nessa fase, ativando o p53 na ausência de MDM-2 e causando apoptose. Consistente com esta interpretação é a observação de que um camundongo nocaute duplo p53, MDM-2 é viável e nasce tão normal quanto um camundongo nocaute p53 (Jones et al., 1995; Montes de Oca Luna et al., 1995). Isso é, portanto, consistente com a ideia de que a proteína MDM-2 atua sem uma atividade de backup da ubiquitina ligase no estágio de blastocisto, mas essas outras proteínas podem permitir uma função mais normal em estágios posteriores de desenvolvimento. Essas ideias agora são testáveis. Também é possível que uma ou mais dessas três ubiquitina ligases estejam envolvidas na manutenção dos níveis de p53 no estado não estressado ou basal, enquanto outras atuam apenas após a produção de p53 induzido por estresse. O p53 ativado e as proteínas p53 induzidas por estresse têm modificações de proteínas muito diferentes e o impacto disso sobre a atividade de MDM-2, Cop-1 ou Pirh-2 atualmente não está claro. Parece provável que cada uma dessas três ubiquitina ligases formem complexos de proteínas na célula e as proteínas associadas podem diferir para cada uma dessas ligases, conectando-as a diferentes circuitos reguladores. No momento, muito se sabe sobre MDM-2 e relativamente pouco foco foi colocado sobre o papel de Cop-1 e Pirh-2, que só foram relatados na literatura no ano passado ou assim. Além disso, muito recentemente a p53 mostrou ser o substrato de outra enzima ubiquitina ligase E3, topors (Rajendra et al., 2004). Resta ser determinado se topors também é um alvo transcricional de p53 e, portanto, deve ser adicionado à lista crescente de proteínas que contribuem para o controle autoregulatório da via de p53. Os próximos anos de estudo devem abordar essas questões.

Como mencionado acima, muitos dos loops regulatórios envolvem MDM-2, destacando assim o papel central do MDM-2 no controle da atividade de p53. Uma análise genética das mutações de p53 e MDM-2 que bloqueiam este complexo proteico identificou resíduos de aminoácidos críticos em cada proteína que são importantes para esta interação de ligação (Lin et al., 1994; Freedman et al., 1997). Foi demonstrado que esses mesmos resíduos de aminoácidos fazem esses contatos de proteínas na estrutura cristalina do terminal amino de HDM-2 (a proteína humana) e um peptídeo do terminal amino de p53 (Kussie et al., 1996) . Os resíduos fenilalanina 19, triptofano 23 e leucina 26 de p53 formam os principais contatos na bolsa hidrofóbica de MDM-2. A fosforilação dos resíduos serina 20 e possivelmente serina 15 deve enfraquecer esses contatos, e os peptídeos e drogas que competem com esses contatos bloqueiam o complexo p53 MDM-2 e promovem a apoptose nas células (Klein e Vassilev, 2004). Assim, o complexo p53-MDM-2 e a atividade da ubiquitina ligase MDM-2 tornaram-se o principal alvo de drogas para alguns tipos de câncer. Em cerca de um terço dos sarcomas humanos e em algumas leucemias e glioblastomas, o gene HDM-2 foi amplificado e essa proteína está superexpressa. O gene p53 é do tipo selvagem e a proteína p53 é aparentemente inativa, de modo que as drogas que quebram o complexo p53-HDM-2 devem ativar o p53. Além disso, muitos outros cânceres parecem expressar o produto do gene HDM-2 em níveis elevados, mesmo quando o gene HDM-2 não é amplificado. Nestes tipos de cânceres, o bloqueio da atividade de HDM-2 ou a liberação de p53 desse complexo podem induzir apoptose seletivamente nas células cancerosas. Isso também pode aumentar a atividade quimioterápica de alguns medicamentos que ativam o p53.

O loop autoregulatório p53-MDM-2 é previsto para configurar um oscilador com níveis de p53 e MDM-2 aumentando e diminuindo com o tempo e fora de fase na célula. Isso foi demonstrado primeiro medindo os níveis de MDM-2 e p53 usando Western blots de proteínas de células em cultura submetidas a uma resposta ao estresse de p53 (Lev Bar-Or et al., 2000). Enquanto as oscilações são observadas e diminuem com o tempo, este experimento calcula a média das concentrações de proteína de muitas células em cultura que podem estar fora de fase em suas oscilações, dando origem a interferências construtivas ou destrutivas. Por esta razão, as proteínas de fusão p53 e HDM2 marcadas com fluorescência foram fotografadas em células individuais para acompanhar as mudanças nos níveis de p53 e HDM-2 em células submetidas a uma resposta ao estresse de p53. As oscilações fora de fase esperadas foram observadas e surpreendentemente o número de oscilações em uma célula foi proporcional à dose de radiação dada a essas células (Lahav et al., 2004). Isso sugere que o p53 pode medir a intensidade de um sinal de estresse de forma digital (número de oscilações) e não de forma analógica (concentrações maiores de p53). Oscilações semelhantes foram observadas em outras vias de transdução de sinal que têm loops autorregulatórios negativos, como a via NF-κ-B com as proteínas NF-κ-B e I-κ-B (Scott et al., 1993). Esses sinais digitais resultantes de oscilações na quantidade de fatores de transcrição podem muito bem resultar em um padrão de expressão gênica periódica. No entanto, como os sinais digitais no nível do fator de transcrição são traduzidos em sinais analógicos no nível da quantidade de mRNA produzido por um gene ainda não está claro. Esses experimentos levam à possibilidade de que diferentes números de oscilações, o tempo ou comprimento de onda das oscilações ou a amplitude dessas oscilações podem impactar o padrão selecionado de expressão gênica e o resultado (parada do ciclo celular, apoptose ou senescência) do p53 resposta.

Por que existem tantos ciclos de feedback no caminho do p53? Existem muitas respostas para esta pergunta. Todos os mecanismos podem não estar ativos na mesma célula ou tipo de tecido ou nos mesmos estágios durante o desenvolvimento. Os circuitos de feedback do tipo descrito aqui fornecem um meio para conectar a via p53 com outras vias de transdução de sinal e coordenar os sinais celulares para crescimento e divisão. As redundâncias em um sistema às vezes podem evitar erros e um sistema de backup reduz o fenótipo de mutações. Por outro lado, nem todos os ciclos de feedback mostrados nas Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 podem resistir ao teste do tempo e à experimentação adicional. Muitas dessas vias foram elucidadas por experimentos realizados com células cancerosas em cultura que apresentam mutações que alteram essas vias. Mesmo as células normais em cultura ou camundongos knockout (devido à acomodação à mutação) podem não refletir todas as condições que ocorrem em células e órgãos normais in vivo. É particularmente difícil provar que uma proteína quinase ou fosfatase específica atua sobre um substrato específico in vivo e tem um resultado que pode ser medido quantitativamente. Portanto, precisamos continuar a testar e desafiar as funções e caminhos que acreditamos operam em uma célula. No entanto, esses construtos, mostrados nas Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, são úteis na formulação de hipóteses e ideias de teste que certamente levarão a novos insights sobre a natureza dos cânceres e o design de drogas e agentes que matam seletivamente as células cancerosas.