Quando a segunda invasão persa da Grécia começou em 481 aC, Leônidas foi escolhido para liderar as forças gregas combinadas, tanto por causa da reputação dos espartanos como um militar superior reino, e por causa de suas próprias proezas como general. Diz-se que o rei visitou o Oráculo em Delfos, que foi consultado sobre questões importantes de estado em toda a Grécia Antiga, e o Oráculo proferiu um grande verso que essencialmente lhe dizia que ele deveria sacrificar sua vida para evitar que seu reino fosse destruído pela Pérsia.
Em agosto de 480 aC, Leônidas marchou ao encontro do exército do rei persa Xerxes nas Termópilas, uma estreita passagem costeira que ficava na rota dos persas para o interior. Ele tinha consigo apenas 300 soldados espartanos de elite e 900 escravos, aos quais ele acrescentou enquanto marchava através do país através de outras cidades-estado, terminando com um exército total de entre 4.000 e 7.000 homens. Várias explicações foram apresentadas para explicar por que a força era tão pequena; Heródoto teorizou que os espartanos marcharam diretamente para que não demonstrassem medo, com a expectativa de que um exército maior seria reunido e o seguiria logo em seguida, mas historiadores modernos acreditam que conflitos internos ou mesmo o fato de que os Jogos Olímpicos estavam ocorrendo na época, poderia ter sido o culpado.
O exército persa que eles enfrentaram era muito numeroso. A estimativa de Heródoto de dois milhões de homens já foi desmentida, mas o número era de pelo menos 70.000 e possivelmente até 300.000. Seguiu-se um impasse de quatro dias, depois os persas atacaram no quinto dia. Por dois dias, os gregos contiveram os persas, matando aproximadamente 10.000 de seus homens, incluindo dois dos irmãos do rei Xerxes. No sétimo dia, um traidor chamado Ephialtes contatou o general persa Hydarnes e mostrou-lhe um caminho escondido que ele poderia seguir para ficar atrás dos gregos. Sabendo que agora estava flanqueado, Leônidas mandou embora todas as tropas gregas, escolhendo permanecer na passagem com seus 300 espartanos e os escravos, 400 tebanos e 700 téspios.
Heródoto registrou que Leônidas mandou os homens embora para garantir que eles viveriam para lutar outro dia e seriam úteis em uma batalha futura contra os persas, e os espartanos ficaram para proteger a fuga dos gregos e porque eles nunca poderiam abandonar sua posição no campo de batalha. Os thespians supostamente foram mandados embora com os outros gregos, mas ficaram para trás por sua própria vontade.
Xerxes alegadamente ofereceu poupar as vidas dos espartanos se eles entregassem as suas armas, ao que Leônidas respondeu ” ΜΟΛΩΝ ΛΑΒΕ ”(venha e leve-os). Os homens então lutaram uma última resistência amarga contra os persas, e todos foram mortos, exceto os 400 tebanos, que se renderam aos persas sem lutar. Depois que Leônidas foi morto, os espartanos lutaram para recuperar seu corpo e evitar que os persas o profanem. Leônidas tinha aproximadamente 60 anos na época de sua morte e foi sucedido por seu filho, Pleistarco.