Uma análise fenotípica e genômica comparativa das cepas de camundongos C57BL / 6J e C57BL / 6N

Comparações da sequência do genoma de camundongos C57BL / 6N e C57BL / 6J para SNPs e pequenos indels

Utilizamos o alinhamento de extremidades emparelhadas de C57BL / 6N com o genoma de referência (C57BL / 6J) do Projeto 17 de Genomas de Rato. No entanto, a lista de variantes de diferenciação (SNPs, pequenos indels e SVs) entre os dois genomas foi criada recentemente usando novos procedimentos embutidos, a fim de aumentar a probabilidade de identificar mudanças de sequência putativas precisas. Uma etapa de análise chave na identificação de um conjunto de variantes de alta qualidade do alinhamento foi utilizar a sequência do genoma de leitura curta recém-gerada de C57BL / 6J gerada pelo Broad Institute. Isso nos permitiu identificar erros de montagem na sequência de referência. Além disso, atualizamos o método de detecção de variantes: primeiro, usando software diferente e / ou mais evoluído para detectar variantes; em segundo lugar, realizando a curadoria manual em todas as variantes de codificação e, em terceiro, pela validação extensiva de uma grande proporção das variantes (incluindo todas as variantes de codificação) para confirmar as previsões de sequência. Essas etapas forneceram um conjunto de dados robusto de variantes de codificação de alta qualidade, reduzindo consideravelmente a taxa de falsos positivos.

Para identificar SNPs e pequenos indels que diferenciam as cepas C57BL / 6J e C57BL / 6N, usamos o par- leituras finais geradas a partir do 17 Mouse Genomes Project. Chamamos as variantes usando o Genome Analysis Toolkit (GATK) e encontramos 681.220 variantes que distinguem as cepas C57BL / 6J e C57BL / 6N. Usando a sequência do genoma de leitura curta de C57BL / 6J gerada pelo Broad Institute, fomos capazes de filtrar erros de sequenciamento prospectivos removendo variantes comuns à sequência Broad C57BL / 6J, neutralizando assim as discrepâncias na referência e melhorando o falso-negativo avaliar. As leituras restantes foram filtradas com uma razão de alelo inferior a 0,8 (heterozigoto) e cobertas por menos de 3 ou superior a 150 leituras. Essas etapas reduziram significativamente a lista, resultando em 10.794 variantes putativas que foram submetidas a análises adicionais.

Usando Sequenom, PyroSequencing e sequenciamento Sanger, validamos todas as variantes de codificação e um subconjunto das variantes não codificantes, que incluiu 762 SNPs e 169 pequenos indels. Os ensaios foram realizados usando um painel de quatro amostras C57BL / 6J e quatro C57BL / 6N para confirmar os genótipos (consulte Materiais e métodos). Consideramos uma variante a ser validada quando todas as quatro amostras C57BL / 6J e C57BL / 6N mostraram genótipos consistentes dentro de uma sub-linhagem e variantes entre as sub-linhagens. Durante o processo de validação, eliminamos 363 variantes por uma série de razões, incluindo genótipos heterozigotos e inconsistentes e falhas de PCR. Para as 568 restantes, 236 foram confirmadas como variantes entre as sub-cepas (consulte o arquivo adicional 1, Tabela S1).

Usando os programas de anotação NGS-SNP e Annovar, a localização genômica e outras características do gene foram examinado. As variantes finais da sequência validada entre C57BL / 6J e C57BL / 6N consistiam em 34 SNPs codificadores, 2 pequenos indels codificadores, 146 SNPs não codificantes e 54 indels pequenos não codificantes. As variantes de codificação incluíram 32 SNPs sem sentido, 1 mutação sem sentido, 1 mutação de splicing e 2 mutações de deslocamento de quadro (Tabela 1). Descobrimos que todas as variantes, exceto uma (Zp2, cromossomo 7) eram privadas de C57BL / 6J ou C57BL / 6N, e não foram encontradas em nenhuma das 16 outras cepas consanguíneas recentemente sequenciadas.

Comparações da sequência do genoma de camundongos C57BL / 6N e C57BL / 6J para variantes estruturais

Novamente, empregando as leituras emparelhadas geradas a partir do Projeto 17 de Genomas de Rato e uma combinação de quatro métodos, identificamos 551 SVs entre C57BL / 6J e C57BL / 6N. Conforme descrito em outro lugar, nós inspecionamos visualmente o mapeamento de extremidade emparelhada de leitura curta nesses 551 locais de SV nas 17 cepas consanguíneas sequenciadas de camundongos e no genoma Broad J sequenciado. Ao fazer isso, fomos capazes de reter 81 dos 551 locais para análises experimentais adicionais (470 locais previstos foram considerados falsos devido a erros de mapeamento de extremidade pareada). As análises de sequenciamento baseadas em PCR e Sanger nesses 81 locais retidos nos permitiram remover mais 38 locais, que foram confirmados como não polimórficos entre C57BL / 6J e C57BL / 6N devido a erros de referência. Finalmente, todas as 43 variantes previstas foram validadas como SVs autênticos, diferenciando as cepas C57BL / 6J e C57BL / 6N (Tabela 2), resultando em uma taxa nula de falso-positivo.

Dos 43 SVs, 15 se sobrepõem a um gene (Tabela 2), incluindo 12 variantes que se encontram em regiões não codificantes de genes, 2 variantes que afetam a região codificadora do gene (Vmn2r65 (Vomeronasal 2, receptor 65) e Nnt (nicotinamida nucleotídeo transhidrogenase), e 1 que afeta todo o gene Cyp2a22 (citocromo P450, família 2, subfamília a, polipeptídeo 22). Apenas 1 das 15 variantes é conhecida e já foi associada a um fenótipo, Nnt; os 14 restantes são novos, e para vários discutimos suas funções biológicas potenciais abaixo.

Usando o rato como uma espécie de grupo externo, inferimos a seguir a origem dos 43 SVs entre C57BL / 6J e C57BL / 6N, e descobriram que 27 variantes eram o produto da retrotransposição, 15 eram SVs não mediados por repetição e 1 era uma repetição em tandem de número variável (VNTR) (Tabela 2). Notavelmente, quase todas as variantes eram privadas de qualquer C57BL / 6J ou C57BL / 6N (Tabela 2).

Avaliação fenotípica abrangente de camundongos C57BL / 6N e C57BL / 6J

Em paralelo com Para as análises genômicas, o consórcio European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) realizou uma comparação fenotípica abrangente das cepas C57BL / 6NTac e C57BL / 6J. EUMODIC compreende quatro centros de camundongos que realizam fenotipagem primária de base ampla de 500 linhas mutantes de mutantes geradas a partir dos projetos European Conditional Mouse Mutagenesis (EUCOMM) e Knockout Mouse (KOMP) dentro do programa IKMC. Coortes de camundongos de cada linhagem mutante entram na avaliação fenotípica slim (EMPReSSslim) do European Mouse Phenotyping Resource of Standardized Screens, que consiste em dois pipelines de fenotipagem, juntos compreendendo 20 plataformas de fenotipagem (identificadas por um ESLIM__procedure_number) que são realizadas de 9 a 15 semanas (consulte o arquivo adicional 2, Figura S1). Os métodos de execução de cada tela são detalhados nos procedimentos operacionais padrão (SOPs) que podem ser encontrados no banco de dados EMPReSS. Os dados foram adquiridos em 413 parâmetros de fenótipo, juntamente com 146 parâmetros de metadados, e inseridos no banco de dados EuroPhenome. Como parte deste trabalho, capturamos dados de controle extensivos sobre o fenótipo de linha de base de C57BL / 6NTac. Também aproveitamos esta oportunidade para investigar o fenótipo de camundongos C57BL / 6J e compará-lo com C57BL / 6NTac (doravante denominados J e N respectivamente).

Para cada linha, N e J, idade camundongos correspondentes foram analisados por meio de ambos os pipelines EMPReSSslim. Os dados foram adquiridos de todos os quatro centros no consórcio para 19 das 20 plataformas do pipeline, excluindo análises de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (ver arquivo adicional 2, Figura S1). Os protocolos EMPReSSslim foram rigorosamente padronizados no consórcio EUMODIC; no entanto, permanecem algumas diferenças, por exemplo, em equipamentos e dieta, e isso é capturado nos conjuntos de metadados no EuroPhenome. Claro que haverá outras diferenças ambientais não reconhecidas entre os centros. Coletivamente, eles podem contribuir para diferenças gene-ambiente e resultados fenotípicos, mas não buscamos definir sistematicamente esses efeitos, em vez disso nos concentramos em fenótipos que são concordantes entre os centros e são claramente robustos a perturbações ambientais não reconhecidas. Os dados das coortes N e J de cada centro foram depositados no EuroPhenome e foram submetidos a uma análise estatística para cada centro (ver Materiais e métodos). É importante notar aqui que as comparações entre N e J foram realizadas dentro, não entre centros. A análise estatística dos resultados entre os centros não foi realizada, uma vez que os experimentos não puderam ser totalmente controlados entre os centros devido a variáveis ambientais e outras e às diferenças no número de animais analisados em cada centro (ver arquivo adicional 3, Figura S2a-d). Assim, optamos por adotar uma abordagem que se concentrava em comparações de cepas dentro de centros individuais, em vez de gerar um modelo estatístico multicêntrico que examinava uma diferença estatística geral entre as duas cepas. No entanto, a replicação da comparação N e J em vários centros nos forneceu poder adicional em substanciar diferenças fenotípicas significativas entre as duas cepas. Além da análise de N e J através do pipeline de fenotipagem primária EMPReSSslim nos quatro centros, outros parceiros dentro do consórcio EUMODIC aplicaram uma gama mais ampla de testes de fenotipagem muitas vezes mais sofisticados para coletar informações adicionais, algumas das quais exploram mais e pretendem substanciar as diferenças fenotípicas reveladas por EMPReSSslim.

Ao analisar os dados, nos concentramos primeiro na identificação de parâmetros fenotípicos que mostraram uma diferença consistente e significativa entre N e J em três ou mais centros.Identificamos 27 parâmetros de fenótipo nesta classe (Figura 1a; consulte o arquivo adicional 3, Figura S2a, e). Em vários casos, essas diferenças foram apoiadas por dados de análises secundárias, e discutiremos esses casos a seguir. Também descobrimos uma segunda classe de parâmetros para os quais tendências semelhantes foram observadas em dois centros, mas nenhuma evidência de tendências foi observada nos outros dois centros (Figura 1b; consulte o arquivo adicional 3, Figura S2b, f). No entanto, nossa análise estatística (consulte Materiais e métodos) indica que, para esta classe de parâmetros, a significância geral das diferenças N versus J é baixa e as tendências observadas devem ser tratadas com cautela. Em vários desses casos, no entanto, as tendências observadas são consistentes com os fenótipos encontrados na primeira classe de parâmetros. Também identificamos uma terceira, mas pequena classe de parâmetros que mostraram diferenças altamente significativas em dois ou mais centros (Figura 2; consulte o arquivo adicional 3, Figura S2d, h), mas inesperadamente, a tendência oposta em um dos centros. Discutimos as razões para essas anomalias, que em alguns casos provavelmente surgem de interações gene-centro. A classe final representa um grande número de testes nos quais não observamos quaisquer diferenças consistentes e significativas entre os centros, concluindo que estes são mais prováveis de serem falsos positivos do que evidências de diferenças N / J (ver arquivo adicional 3, Figura S2c , g).

Dismorfologia e oftalmologia

Não encontramos evidências de quaisquer diferenças importantes nas características morfológicas entre N e J, incluindo análise de raios-X do esqueleto. No entanto, uma série de diferenças oftalmológicas entre as duas cepas foram identificadas. A análise das funções visuais gerais usando o tambor optocinético virtual encontrou visão reduzida em N em comparação com camundongos J (N: 0,314 ciclo / grau, IC 95% 0,305 a 0,323, n = 89; J: 0,399 ciclos / grau, IC 95% 0,394 a 0,404, n = 128; p < 0,001, teste t de Student). Isso não refletiu diferenças nas opacidades das lentes, pois a análise quantitativa usando uma câmera Scheimpflug encontrou lentes transparentes em ambas as cepas (N: 5,2 + 0,5%, n = 10; J: 5,0% + 0,5% de opacidade, n = 10). Manchas brancas foram vistas no fundo de camundongos N em uma frequência alta, que estavam ausentes em camundongos J ( Figura 3A). Isso provavelmente se deve à presença da mutação Crb1rd8 em camundongos N, conforme relatado anteriormente, embora em nosso caso as manchas tenham sido vistas apenas na retina ventral, com variações no tamanho da mancha e na área afetada entre os camundongos (Figura 3A) . Outros estudos usando endoscopia de fundo de olho tópica mostraram que o número de vasos principais era variável, variando entre três e sete para veias e três e oito ht para artérias (Figura 3B), e um determinado rato pode ter números não correspondentes entre os dois olhos. O número médio de veias e artérias foi significativamente maior (P < 0,001) em camundongos J do que em N (Figura 3C).

Cardiovascular

Medições de pressão arterial não invasivas (ESLIM_002) mostraram que a pressão arterial sistólica foi significativamente maior em camundongos J do que em N, embora a significância do efeito tenha sido considerada variável entre os sexos e entre os centros. Além disso, todos os centros observaram que a taxa de pulso foi significativamente maior em ratos N do que em J.No entanto, um parceiro secundário dentro do consórcio descobriu que a freqüência cardíaca sob anestesia era significativamente menor em camundongos N do que em J machos, refletida em um longo intervalo entre batimentos (RR) e QTc. Também descobrimos que o peso do coração normalizado para o comprimento da tíbia (ESLIM_020) foi significativamente menor em camundongos N do que em J em dois dos centros, e esses resultados foram independentemente confirmados por análise secundária. Estudos adicionais da estrutura e função cardíaca por ecocardiografia e da função contrátil cardíaca por hemodinâmica não revelaram quaisquer diferenças entre N e J (dados não mostrados).

Metabolismo

Para medições de calorimetria indireta de ratos alimentados livremente (ESLIM_003), encontramos uma diferença consistente entre N e J para o consumo de O2, produção de CO2 e produção de calor. Camundongos J apresentaram troca gasosa reduzida e menor gasto de energia (produção de calor ou taxa metabólica) em comparação com N, que geralmente era mais acentuado em mulheres. Na fenotipagem secundária com calorimetria indireta em jejum, houve tendência de menor gasto energético em J versus N durante o período noturno. Isso foi possivelmente associado à diminuição da atividade ambulatória em J e menor ingestão de alimentos em J em comparação com N durante o período noturno, especialmente na realimentação (dados não mostrados). Não houve diferença consistente na atividade na tela de calorimetria de alimentação livre (ESLIM_003) nos dois centros onde a atividade foi medida (consulte o arquivo adicional 3, Figura S2c, g). Os testes de tolerância à glicose intraperitoneal simplificados (IPGTTs) (ESLIM_004) mostraram tolerância à glicose diminuída em camundongos J versus N. Essas observações sobre o metabolismo da glicose são consistentes com a exclusão conhecida do gene Nnt específico para camundongos J, que demonstrou desempenhar um papel na regulação da resposta à insulina em células beta pancreáticas.

Dupla energia X A absortometria de raios-raios (DEXA) e as medidas de densitometria óssea e a composição corporal (ESLIM_005) mostraram que N camundongos aumentaram a massa gorda (tanto absoluta quanto normalizada para o peso). Além disso, as medições DEXA indicaram que os camundongos J aumentaram a massa magra em comparação com N. Em dois dos centros, as medições da densidade mineral óssea foram maiores em camundongos J machos; no entanto, esse achado não foi replicado no terceiro centro que realizou as telas DEXA. Passamos a realizar a análise de micro-tomografia computadorizada (μCT) das duas cepas (Figura 4) e descobrimos que a espessura cortical, a porosidade cortical e o volume do osso trabecular permaneceram inalterados entre N e J. Além disso, a análise de várias microarquitetura parâmetros indicaram que a rede trabecular geral era semelhante. Finalmente, a medição da formação óssea e os marcadores de reabsorção não revelaram quaisquer diferenças entre as duas cepas (Figura 4).

Neurológico, comportamental e sensorial

Dois centros mostraram diferenças importantes e consistentes entre N e J na atividade em campo aberto (ESLIM_007) (Figura 2), incluindo maior atividade em camundongos J medida pela distância percorrida e um maior número de entradas no centro, indicativo de ansiedade reduzida. Essas diferenças estão de acordo com os dados relatados recentemente em uma comparação comportamental de N e J. Curiosamente, os efeitos mais significativos limitaram-se aos homens nos dois centros. Inesperadamente, em um terceiro centro, o inverso foi visto, com N camundongos sendo mais ativos do que J, embora esses efeitos tenham sido observados em machos e fêmeas. Um quarto centro não detectou esses efeitos, não encontrando diferenças significativas. Todos os centros usavam o EMPReSSslim SOP para o procedimento, que incluía a exigência de arenas de tamanho semelhante, mas havia algumas diferenças operacionais entre os centros, incluindo o uso de salas simples ou múltiplas para abrigar as arenas; arenas com lados transparentes ou opacos; e a ausência ou presença de enriquecimento ambiental nas gaiolas domésticas (que é conhecido por ter um efeito nos resultados comportamentais). No entanto, nenhuma dessas variáveis foi consistente com as observações divergentes entre os centros.No entanto, não podemos excluir as influências do microbioma intestinal, que pode ser diferente entre os centros. O microbioma intestinal é conhecido por influenciar a função e o comportamento do sistema nervoso central, principalmente por meio do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. Concluímos que, sob certas condições, diferenças significativas nos parâmetros de campo aberto entre N e J podem ser vistas, mas a natureza dessas diferenças é sensível a condições ambientais desconhecidas. É interessante que o principal achado contraditório nos fenótipos N versus J foi confinado a uma plataforma de fenotipagem comportamental. Em contraste, para a maioria dos outros testes (além de alguns parâmetros hematológicos e de química clínica, veja abaixo), não encontramos inconsistências, indicando que, ao contrário da maioria das plataformas de fenotipagem, as análises comportamentais podem ser extremamente sensíveis aos parâmetros ambientais.

Também realizamos um teste de transição claro / escuro para comparar a ansiedade nas cepas N e J (Figura 5). Não encontramos diferenças significativas entre os ratos N e J no número de transições claro-escuro ou na porcentagem de tempo gasto no compartimento escuro. No entanto, a latência para entrar no compartimento escuro foi significativamente maior em N camundongos. O teste SHIRPA modificado (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phenotype Assessment) (ESLIM_008, Figura 1a) em todos os quatro centros indicou que camundongos J machos aumentaram significativamente a atividade locomotora, o que se correlacionou com os achados de aumento da distância percorrida testes de campo aberto em alguns centros (veja acima).

Conduzimos uma série de testes que refletem a capacidade motora. Diferenças na força de preensão (ESLIM_009) foram vistas em todos os centros com J sendo maior do que N, mas os parâmetros afetados foram diferentes, com alguns centros relatando diferenças na força de preensão dos membros anteriores e alguns para força de preensão dos membros anteriores e posteriores combinados (Figura 1a , b). O teste de Rotarod (ESLIM_010) mostrou diferenças significativas na latência para queda em todos os centros, embora a capacidade motora reduzida de N tenha sido observada apenas para mulheres em dois dos centros. Exploramos ainda mais as habilidades motoras em camundongos machos N e J, examinando o desempenho do aprendizado motor no rotarod ao longo de 4 dias (Figura 5). Enquanto o desempenho motor dos camundongos J melhorou acentuadamente do dia 1 ao dia 2, o desempenho dos camundongos N melhorou apenas gradualmente e foi significativamente diferente das medições do dia 1 apenas a partir do dia 3 (P < 0,05) em diante. Além disso, do dia 2 ao dia 4, houve diferenças altamente significativas na latência para cair entre N e J. O teste primário realizado nos centros revelou, assim, um potencial desempenho motor reduzido em N que foi confirmado e elaborado por testes mais sofisticados do desempenho da aprendizagem motora.

Também realizamos dois testes comportamentais adicionais para elaborar melhor as diferenças N versus J. Em primeiro lugar, comparamos o desempenho de N e J no teste de labirinto aquático de Morris usado para avaliar a memória espacial. Camundongos machos N apresentaram desempenho significativamente reduzido (latência mais alta) em comparação com camundongos machos J (Figura 6). Em segundo lugar, examinamos o aprendizado emocional ou a memória para um evento aversivo usando os testes de condicionamento de medo contextual e pista; no entanto, aqui não encontramos diferenças significativas entre as duas cepas (dados não mostrados).

Exploração de sobressalto acústico e inibição de pré-pulso (ESLIM_011) (Figura 1a) nas duas cepas identificou uma variedade de parâmetros que eram significativamente e consistentemente diferentes entre os centros. A magnitude do sobressalto acústico a 110 dB e a magnitude da resposta do sobressalto ao pré-pulso e pulso (PP1-PP4 + pulso, consulte EMPReSSslim) foram reduzidos em N em comparação com J, embora este efeito não tenha sido observado em mulheres em um centro. Consistente com essas observações, descobrimos que a inibição do pré-pulso diferia entre N e J, com a inibição do pré-pulso em PP2 e PP3 e a inibição global aumentada em N em comparação com J. Vários outros parâmetros de magnitude de sobressalto e inibição de pré-pulso mostraram efeitos significativos em um ou dois centros (Figura 1b; consulte Arquivo adicional 3, Figura S2b, f), mas nenhuma diferença foi observada em outros centros. As observações na magnitude do sobressalto não foram confundidas por diferenças na audição, pois avaliamos os limiares auditivos em camundongos J e N usando o teste de resposta auditiva do tronco cerebral e não encontramos diferenças (dados não mostrados).

Química clínica

Painéis extensivos de testes de química clínica foram realizados em amostras de plasma coletadas no final de cada pipeline de fenotipagem. A amostra de sangue no final do Pipeline 1 (ESLIM_021) foi coletada após um jejum noturno, enquanto a amostra no final do Pipeline 2 (ESLIM_015) era de um animal alimentado de graça.Dados concordantes de pelo menos três centros mostraram que a ureia e os eletrólitos sódio, potássio e cloreto foram significativamente mais elevados no plasma de camundongos J em relação aos camundongos N (Figura 1a), embora houvesse algumas interações sexo-centro claras. Os dados para os níveis de glicose no plasma em jejum e em alimentação livre indicaram que, para cada teste, pelo menos dois centros encontraram os níveis de glicose no plasma mais elevados em camundongos N do que em J (Figura 1b). No entanto, sabe-se que os níveis de glicose no sangue são afetados pelo manuseio dos animais, processamento de amostras e uso de anestésicos. Os dados apresentados aqui são todos de amostras coletadas sob anestésico isofluorano gasoso, além de um centro no qual as amostras foram coletadas sob injeção de cetamina / xilazina (ver Figura 1). Conforme discutido acima, devido ao seu conhecido comprometimento na secreção de insulina, parece contraditório para camundongos J terem níveis de glicose plasmática mais baixos do que camundongos N, mas a deleção em Nnt parece afetar apenas as taxas de depuração de glicose e camundongos J em jejum ou não desafiados não tem hiperglicemia constante. Vários outros parâmetros mostraram ser maiores em camundongos J do que em N em pelo menos dois centros, mas em cada caso o (s) outro (s) centro (s) não relataram diferenças significativas nos mesmos parâmetros (Figura 1b), por exemplo, ácidos graxos livres. Dois centros descobriram que o ferro era significativamente maior em homens N e que a fosfatase alcalina era significativamente maior em homens J. Um desses centros também descobriu o mesmo para mulheres (Figura 2). No entanto, os dados para cada um desses parâmetros de um terceiro centro contradizem esses achados.

Hematologia

Vários parâmetros hematológicos foram medidos no final do Pipeline 2 (ESLIM_016). Alterações significativas em uma série de parâmetros foram encontradas por dois centros, mas esses resultados não foram replicados nos outros, incluindo contagens de glóbulos brancos e vermelhos, volume celular médio e hemoglobina corpuscular média (Figura 1b). Resultados contraditórios foram obtidos para os testes de hematócrito e concentração média de hemoglobina celular (Figura 2). Em cada caso, os dados de dois centros concordaram, enquanto um terceiro centro mostrou o efeito oposto. Isso poderia ser devido às diferentes tecnologias de máquina usadas para medições hematológicas nas clínicas participantes, conforme registrado nos metadados.

Função imunológica e alergia

Nós investigamos vários fenótipos secundários incluindo resistência do hospedeiro a Listeria monocytogenes nas cepas J e N. As fêmeas de ambas as cepas foram mais suscetíveis à infecção por L. monocytogenes; no entanto, a diferença de sexo na suscetibilidade do hospedeiro Listeria foi menos pronunciada em N do que em J. Os machos da cepa N mostraram maior depuração de Listeria no dia 4 pós-infecção em comparação com os machos J. Isso se correlaciona com uma resposta pró-inflamatória aumentada em N machos no dia 3 pós-infecção em comparação com J machos (Figura 7).

Também testamos camundongos N e J para hipersensibilidade de contato induzida por dinitrofluorobenzeno (DNFB) (CHS). Diferenças significativas na resposta de CHS foram identificadas entre as duas linhagens de camundongos, com J mostrando uma resposta de CHS aumentada. Visivelmente, camundongos fêmeas de ambas as cepas mostraram um aumento de CHS em comparação com camundongos machos. A investigação da capacidade de resposta das células natural killer (NK) a vários estímulos mostrou que uma fração maior de células NK são ativadas pela interleucina (IL) -12 sozinha ou em combinação com IL-2 em J em comparação com camundongos N; novamente, essa resposta foi mais significativa no sexo feminino (Figura 8).